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Ver el documento (formato PDF)   Caimi, Karina Cynthia.  "Genómica comparativa en micobacterias responsables de enfermedades zoonóticas pertenecientes al Complejo Mycobacterium tuberculosis"  (2004)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El Complejo M tuberculosis (CMT) está formado por distintas especies de micobacterias entre las que se encuentra el agente causal de la tuberculosis en humanos, Mycobacterium tuberculosis y micobacterias responsables de enfermedades zoonóticas como M. bovis, M. microti y M. pinnipedii. La genómica comparativa en micobacterias brinda una vasta información acerca de la relación entre los genomas de distintas micobacterias pertenecientes al CMT. En la primera parte de este trabajo se estudió la Región de Repeticiones Directas (DR). Esta región está compuesta por repeticiones directas conservadas de 36pb separadas por secuencias no repetitivas llamadas espaciadores (sps). El polimorfismo observado en esta región entre aislamientos de micobacterias pertenecientes al CMT dio origen a la técnica de tipificación, ampliamente aplicada en tuberculosis denominada Spoligotyping. La secuenciación y comparación de la región DR entre distintos aislamientos argentinos de M. bovis permitió encontrar 5 espaciadores nuevos. Estos espaciadores conjuntamente con una colección de otros descriptos previamente, fueron incluidos en una nueva membrana de spoligotyping obteniéndose un total de 104 espaciadores. La utilización del spoligotyping de lO4-sps. permitió la diferenciación de aislamientos del CMT en 174 spoligotipos, mientras que el uso de la membrana tradicional tipificó estos mismos aislamientos en 160 spoligotipos distintos. Particularmente para M. bovis se obtuvo un incremento de 17 a 26 spoligotipos respectivamente. El análisis comparativo in silico en micobacterias no pertenecientes al CMT como M. smegmatis, M. avium, M. marinum y M. leprae, permitió establecer que los marcos de lectura abiertos (MLAs) flanqueantes a la Región DR de M. tuberculosis, se encuentran adyacentes entre sí en estas otras micobacterias. En cambio en el genoma de M. tuberculosis esta región comprende 24kb. que incluyen 23 MLAs así como la región DR ausentes en las mencionadas micobacterias. Este resultado fue corroborado in vitro mediante amplificación por PCR. Debido a la ausencia del locus DR descripto y los MLAs adyacentes, en M. avium y M. smegmatis y debido a que estas micobacterias fueron descriptas como más antiguas que M. tuberculosis, se postula que esta región podría haber sido adquirida por las especies del CMT o por un ancestro común a ellas a lo largo del proceso evolutivo. La segunda parte de este trabajo implicó el estudio de la variabilidad genética entre distintos aislamientos de M. bovis, M. microti y M. pinnipedii, estas últimas responsables de tuberculosis en ratones de campo denominados “vole” y en mamíferos marinos respectivamente, mediante comparación de genomas completos. Se encontró una nueva deleción en M. microti denominada MiD4. Esta región remueve 5 genes que codifican para antígenos de la familia ESAT-6 y PE-PPE. En M. pinnipedii se encontraron dos nuevas deleciones, PiD1 que removió dos genes, uno de los cuales codifica para una oxidoreductasa (Rv3530c) involucrada en el metabolismo celular. La segunda deleción PiD2, fue denominada como RD2seal debido a estar superpuesta con la región de 10.7kb, RD2, ausente en algunas M. bovis BCG. Esta región abarca los genes Rv1977 y Rv1978. Los experimentos de Southern blot mostraron que MiD4 está también ausente en M pinnipedii, en cambio PiDl es una deleción específica para M. pinnipedii. Por otra parte mediante la comparación del genoma de M. bovis con el genoma de M. tuberculosis in silico, se pudieron identificar nuevos marcadores capaces de diferenciar entre estas dos especies y respecto de otras especies del CMT. Uno de estos nuevos marcadores denominado rpfA presentó polimorfismos en los aislamientos de M. bovis estudiados, lo que podría ser usado en la tipificación y diferenciación.

Abstract:
The Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) is composed by different mycobacteria species, the agent of human tuberculosis and mycobacteria responsible of zoonotic disease as M. bovis, M. microti and M. pinnipedii are among them. Comparative genomics gives broad information about the relationship between the different micobacterial genomes of the MTC. In the first part of this work the Direct Repeat (DR) region was studied. The DR region is composed of multiple well-conserved 36-bp DRs interspersed with non-repetitive DNA spacer sequences (sps). The polymorphism in the DR region has led to the development of a methodology highly applied in tuberculosis research called Spoligotyping. Upon analysis of this region in argentine bovine isolates of M. bovis, five new spacers were detected. These spacers and a collection of others previously described were included in a new spoligotyping membrane reaching a total of 104 different spacers. The application of the lO4-sps spoligotyping allows the differentiation of isolates from the MTC in 174 spoligotypes while with the application of the traditional membrane 160 spoligotypes were obtained. The discriminatory power of M. bovis isolates was increased from l7 to 26 different patterns respectively. The comparative analysis in silico performed in mycobacteria not-belonging to the MTC as M. smegmatis, M. avium, M. marinum and M. leprae allow to establish that the open reading frames (ORFs) flanking the DR region of M. tuberculosis are adjacent in these mycobacteria. In M. tuberculosis genome, this fragment includes 24kb. with 23 ORFs absent from the referred mycobacteria. This observation was experimentally confirmed by PCR. As the DR locus and the ORFs around it, are absent in M. smegmatis and M. avium and, as it is possible that these species are older than M. tuberculosis, we postulated that the DR locus was acquired by the MTC species or by an ancestor bacterium during evolutionary process. In the second part of this work the genetic variability of different isolates of M. bovis, M. microti and M pinnipedii, these last species agents of tuberculosis in wild voles and marine mammals respectively, was studied by whole genome sequence analysis. A novel M. microti deletion was found here called MiD4. This region removes 5 genes that code for ESAT-6 family antigens and PE-PPE. Two new deletions were found in the M. pinnipedii isolates: PiD1, which removes two genes where one of them code for an oxidoreductase (Rv3530c) involved in cellular metabolism. A second deletion found in M. pinnipedii isolates, PiD2, has been recently defined as RD2 seal since it overlaps the 10,7 kb RD2 region. This region encompasses Rv1977 and Rv1978 genes. Southern blot experiments showed that MID4 was also deleted from M. pinnipedii, but PID1 is a deletion specific to M. pinnipedii. By the other hand the analysis in silico between the M. bovis and M. tuberculosis genomes, allow the identification of new markers. These markers were used to differentiate between both species and from another species. One of these new markers called rpfA, present polymorphism between M. bovis isolates. This polymorphism could be used in typification and differentiation.

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Registro:
Título : Genómica comparativa en micobacterias responsables de enfermedades zoonóticas pertenecientes al Complejo Mycobacterium tuberculosis    
Autor : Caimi, Karina Cynthia
Director : Cataldi, Angel Adrián
Año : 2004
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Castelar. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVYA). Instituto de Biotecnología
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3724_Caimi
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Microbiología
Biología / Genética
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