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Ver el documento (formato PDF)   Cordo, Sandra M..  "Interacción del virus Junín con el citoesqueleto y la membrana de la célula huésped"  (2004)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
EI virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, es un miembro de la familia Arenaviridae. Es un virus envuelto de genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación ha sido caracterizado en varios aspectos. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de PH. Una vez que la nucleocápside se encuentra dentro del citoplasma se expresan 5 proteínas estructurales, mediante una estrategia de codificación ambisense. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside es denominada NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), sintetizado en el retículo y exportado a la membrana plasmática de la célula, se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2. Ambas conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. Se desconocen hasta el momento los mecanismos detallados y las estructuras celulares involucradas en el transporte de las distintas proteínas virales hacia el sitio de brotación. El ensamblado de las partículas virales se lleva a cabo en la membrana plasmática de las células infectadas. En este trabajo se estudiaron algunos aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando la asociación de NP, GPC y GP1 a distintas estructuras celulares. En primer lugar se estudió la interacción del virus con la red de filamentos intermedios (FI) del citoesqueleto. Se utilizó el compuesto acrilamida capaz de desorganizar específicamente los FI. La producción de virus infeccioso disminuyó de manera dosis-dependiente en presencia del mismo. Los resultados, observados en celulas Vero, cultivos de fibroblastos humanos y astrocitos murinos, fueron comparables. Se analizó luego el efecto del compuesto sobre diferentes pasos del ciclo de multiplicación. De esta manera se determinó que la integridad de los FI es crucial al menos durante los pasos previos a la síntesis de proteínas virales y posteriores a la internalización. Mediante extracciones específicas realizadas con detergentes no iónicos se encontró que NP se asocia a la fracción celular correspondiente al citoesqueleto, aunque no se determinó a que componente correspondería esta interacción. Las glicoproteínas no mostraron asociación específica a estas fracciones celulares en iguales condiciones. Por otro lado, modificaciones en el contenido de colesterol de las células infectadas y tratadas con inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa, disminuyeron la infectividad y localización de las glicoproteinas en la membrana de las mismas. Estos resultados llevaron al análisis de la asociación de GPC y GP1 a estructuras de membrana ricas en colesterol denominadas rafts. Los ensayos de fraccionamiento celular específicos para estos microdominios de membrana mostraron la localización de las glicoproteínas en rafts. Esta interacción fue dependiente de la temperatura y de la presencia de colesterol en los cultivos infectados. Además, la asociación de las glicoproteínas a las fracciones rafts fue estabilizada a 37°C por la adición de anticuerpos específicos. Estos resultados sugieren la utilización de esta vía como mecanismo de transporte para GPC y GP1 a la membrana celular de las células infectadas. Asimismo la localización de las glicoproteínas en los microdominios rafts podría representar una estrategia para el reclutamiento de los componentes virales previo al paso de liberación de la progenie en las células infectadas.

Abstract:
Junin virus (JUNV), the etiological agent of argentine hemorrhagic fever, is a member of the Arenaviridae family. The viral cycle multiplication of this RNA virus has been characterized in different aspects. The entrance in the target cells is performed by receptor-mediated endocytosis following pH dependant fusion step. Once the nucleocapsids are within the cytoplasm the ambisense strategy allows expression of five structural proteins. The major nucleocapsid associated protein is named NP. As a result of the glycoprotein precursor synthesis and after its maturation and exocytic transport to plasma membrane of infected cells, two glycoproteins are obtained. Both proteins, named GP1 and GP2, form the claviform structures found in the viral envelope. At this moment, the detailed mechanisms and cellular structures involved in the transport of different viral proteins towards the budding site are not known although the fact that viral assembly is carried out in plasma membrane of infected cells is currently accepted. In this work we have studied some aspects of virus-cell interaction characterizing the association of NP, GPC y GP1 to cellular structures. First, we have studied the interaction between virus and cytoskeletal intermediate filaments (IF). In the presence of acrylamide, compound that selectively disrupt IF, viral yield was diminished. The results were similar in Vero cells, human fibroblast cultures and murine astrocytes. Then, we analyzed the effect of acrylamide on different steps of the multiplication cycle. It was determined that IF integrity is essential at least between the step of internalization and viral protein synthesis. Detergent extractions of infected cultures demonstrated that NP associates to cellular cytoskeletal fraction although it was not possible to identify the specific cytoskeletal framework involved in that association. Glycoproteins did not show specific association to these cytoskeletal fractions under similar conditions assayed. On the other hand, modifications in the cholesterol contents of infected cells induced by HMG-CoA reductase inhibitors, diminished infectivity and glycoproteins membrane localization. This result leded us to analyse the association of GPC and GP1 to membrane cholesterol enriched structures named rafts. Specific cellular fractionation assays showed glycoproteins associated to raft microdomains. This interaction was temperature and cholesterol dependant. Moreover, glycoprotein association to membrane rafts was stabilized at 37°C by specific antibody addition. These results suggest that GPC and GP1 may utilize the exocytic raft pathway to reach the plasma membrane of infected cells. Finally, glycoproteins raft association may represent the strategy to recruit viral proteins before releasing progeny from the cells.

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Registro:
Título : Interacción del virus Junín con el citoesqueleto y la membrana de la célula huésped     =    Junin Virus interaction with the cytoskeleton and the cellular membrane
Autor : Cordo, Sandra M.
Director : Candurra, Nélida A.
Año : 2004
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Virología
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3725_Cordo
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Virología
Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : Virus Junín; Filamentos Intermedios; Fraccionamiento celular; Microdominios de membrana; 
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