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Ver el documento (formato PDF)   Pérez, Martín Mariano.  "Catecolamina - beta alanil ligasa (cbal), enzima clave en el metabolismo de neurotransmisores en los insectos"  (2004)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
En la presente Tesis se ha estudiado la enzima NBAD-sintetasa, responsable de la síntesis de NBAD, el principal precursor de esclerotización de las cutículas marrones de los insectos. Se la caracterizó en detalle y se estudió su expresión en el ciclo de vida de C. capitata. El aporte principal ha sido, justamente, el estudio en detalle de esta enzima. Anteriormente a esta Tesis, ésta era una enzima prácticamente desconocida. Si bien se había postulado que el NBAD era el principal precursor de esclerotización de las cutículas marrones de los insectos, excepto nuestro laboratorio, nadie había publicado nada sobre la enzima que lo sintetiza. Se determinó la expresión de la NBAD-sintetasa en la metamorfosis. Se la caracterizó y se demostró que la misma posee una amplia especificidad de sustratos. Se demostró por primera vez la actividad de esta enzima en sistema nervioso y respuesta inmune. Se clonó y secuenció por primera vez un mutante melánico de D. melanogaster, carente de esta actividad enzimática. Por su amplía especificidad de sustratos hemos denominado a esta enzima como Catecolamina-B-alanil ligasa (CBAL). Los principales resultados obtenidos son: -Se determinó el patrón de expresión de la enzima en el tejido epidérmico durante el ciclo de vida de C. capítata. La actividad de esta enzima se detectó en momentos muy acotados del ciclo de vida, coincidiendo con los momentos en que los individuos necesitan esclerotizar sus cutículas. Esta actividad es dependiente de la hormona de la muda 20-OH-ecdisona. La actividad está ausente en el tegumento de las larvas, pues las mismas son de cutícula blanda y no sufren el proceso de esclerotización. El primer momento durante el ciclo de vida en que se detectó la actividad fue en las prepupas cuando se forma el pupario. Luego de varias horas la actividad fue indetectable hasta el estadío de adulto farado donde se volvió a registrar la actividad extendiéndose ésta hasta la emergencia del adulto. -Se descubrió y se dosó por primera vez in vitro la actividad NBAD-sintetasa en tejido nervioso. Se estudió el patrón de expresión y se determinó que la actividad en este tejido es constante a lo largo del ciclo de vida. Incluso se detectó actividad en el “cerebro” de las larvas, hecho significativo puesto que en este estadío nunca se detectó esta actividad en la epidermis. En adultos se demostró que la actividad en el sistema nervioso permanece constante durante todo el estadío, mientras que en la epidermis, luego de las primeras 48 horas, cuando ya ha finalizado el proceso de la esclerotización, no se detecta más la actividad. - Por primera vez se observó que la NBAD-sintetasa participa en la respuesta inmune innata de los insectos. Esta actividad se manifiesta solamente cuando los individuos son invadidos por un patógeno o cuando se produce una injuria en la cutícula. También se determinó la función antibacteriana del NBAD. - Se caracterizaron las diferentes actividades enzimáticas y se concluyó que todas corresponderían a una misma enzima. La misma mostró una amplia especificidad de sustrato, siendo capaz de conjugar β-alanina con catecolaminas, indolaminas e imidoaminas. Por primera vez se logró sintetizar in vitro: NBANE, NBAOA; NBATA, NBASHT, NBAHA (carcinina) y NBATyr (sarcofagina). Debido a la amplia especificidad de sustrato que mostró, hemos denominado a esta enzima como “Catecolamina-β-alanil ligasa” (CBAL). - Se estudiaron los mutantes melánicos niger de C. capitata y ebony de D. melanogaster. Se determinó que ambos mutantes son homólogos; los dos carecen de la actividad NBAD-sintetasa en epidermis (esclerotización y respuesta inmune) y en sistema nervioso. Ambos mutantes muestran deficiencias en el comportamiento. El estudio de los mutantes demostró que las proteínas responsables de las actividades enzimáticas corresponden a un único gen. - Se clonó y secuenció el gen ebony de D. melanogaster en la cepa salvaje y el mutante e4. Se demostró, mediante Northern blots, que el ARNm del mutante es de menor tamaño que el de la cepa salvaje. Luego se secuenció y se comprobó que el gen del mutante posee una deleción de 447 pb en el primer exón. Además se observó que en el sitio de la deleción se insertaron 15 nucleótidos pertenecientes a una secuencia extraña, la cual fue analizada y arrojó homología con una secuencia perteneciente a un gen de baculovirus. Se analizó, además, la región promotora y se encontraron secuencias de reconocimiento para genes que responden a 20-OH-ecdisona, factores de transcripción que actúan en tejido epidérmico, tejido nervioso o en la respuesta inmune. - Se comenzó a estudiar preliminarmente la enzima NBAD-hidrolasa. La misma mostró un patrón de expresión diferente a la sintetasa. La expresión de esta enzima se registró durante todo el ciclo de vida. También se observó que se expresa en tejido nervioso. Esta enzima también mostró una amplia especificidad de sustrato, siendo capaz de hidrolizar los diferentes productos que sintetiza la NBAD-sintetasa. Los resultados obtenidos han permitido poner en evidencia la actividad de la enzima CBAL durante el ciclo de vida de C. capitata y los procesos fisiológicos en los que interviene, claves en la evolución de los insectos. También se abrió un nuevo panorama en el estudio del metabolismo de aminas biogénicas y se aportó información para conocer el metabolismo de β-alanina en insectos.

Abstract:
In the present Thesis it has been studied the enzyme NBAD-synthase, responsible for the syntesis of NBAD the main precursor for tanning and sclerotization the insect brown cuticles. This enzyme has been characterized and was studied its expression profile in the C. capitata life cycle. The principal contribution has been the detailed study of this enzyme. Before this Thesis, it was an almost unknown enzyme. It has been postulated that the NBAD is the main precursor for the sclerotization of insect brown cuticles, but except our laboratory, nobody has published anything about the synthesizing enzyme. It has been determined the expression profile of the enzyme during C. capitata metamorphosis. It has been observed that this enzyme showed a wide substrate specificity. For the fisrt time it has been demonstrated the activity of this enzyme in nervous tissue and in innate immune response. It has been cloned and sequenced for the first time a Drosophila melanogaster melanic mutant, lacking the NBAD-synthase activity. Due to its wide substrate specificity we proposed identify it as Catecholamine B-alanyl-ligase (CBAL). The main obtained result are: - It has been determined the expression profile of the enzyme in the epidermal tissue during the life cycle of C. capitata. The activity of this enzyme has been detected in narrow developmental windows in differents stages during the life cycle. All those developmental windows where the enzyme was expressed were in coincidence with the momment when the fly must sclerotize its cuticle. This activity is absent in the larval integument, this is because they are maggots with soft cuticle and it never suffer the sclerotization process. The first time when this activity has been observed was in the prepupa, during puparium formation. After several hours the activity disappeared until the pharate adult stage when it was evident again and remained until the imago emergence. - It has been discovered and determined for the first time the activity of this enzyme in the nervous system of insects and we showed that this activity is expressed constitutively during the whole life cycle. Indeed the activity was measured in the larval brain, this is striking because the activity is absent from the epidermal tissue. It has been shown that in the adult stage while the epidermal activity drops to undetectable levels, after the first 48 hours, when the sclerotization process had finished, in nervous tissue it kept on constant. - It was observed for the first time that NBAD-synthase is activated during the immune response in insects. The NBAD-synthase is activated only when the insect is infected by a microorganism. It has been also demonstrated the antibacterial activity of NBAD. - It has been characterized the different enzymatic activities and it was observed that all of them belong to the same enzyme. This enzyme showed a wide substrate specificity, being capable of synthesize different β-alanyl derivatives of catecholamines, phenolamines, indolamines and imidoamines. It has been synthesized, for the first time in vitro: NBANE, NBAOA, NBATA, NBASHT, NBAHA (carcinine) and NBATyr (sarcophagine). Due to its broad substrate specificity we proposed identify it as Catecholamine β-alanyl ligase (CBAL). - It has been studied the melanic mutants niger of C. capitata and ebony of D. melanogaster. It has been shown that both mutant are homologous, this two mutants lack the NBAD-synthase activity in the integument (sclerotization and immune response) and in the nervous tissue. These both mutants also have behavioural anomalies. The studies carried out on these mutants demonstrated that the responsible enzymatic activities are codified by an unique gene. - It has been cloning and sequenced the ebony gene from D. melanogaster wild type and ebony4 (e4) strains. By Northern blot assays has been observed that the mutant mRNA is smaller than the wild type one. Thereafter by sequencing it has been demonstrated that the mutant gene has a 447 bp deletion in its first exon. Moreover it has been observed in the deletion site 15 exogenous nucleotides inserted, and it sequence showed great similarity with a baculovirus gene. It has been studied the expression pattern in the D. melanogaster life cycle. Using a computational program it has been analized the promoter region of this gene and it has been observed the presence of sequences for different transcription factor recognition sites, such as those that respond to 20-OH ecdysone, transcription factor that are expressed in epidermal or nervous tissue and those that modulate the immune response. - Preliminary it has begun to be studied the enzyme NBAD-hydrolase. This enzyme showed an expression pattern different for that of NBAD-synthase. The expression of the former has been detected during the whole life cycle of C. capitata. As it occurs with the NBAD-synthase, the NBAD-hydrolase is also expressed in nervous system and is capable to hydrolisate the alternative products synthesized by the NBAD-synthase. All these results has allowed to show the activity of CBAL during the whole life cycle of C. capitata and the physiological process where it participates, very important during the evolution of insects. A new subjet in the study of metabolism of biogenic amines has been opened and it has been given a new information on the metabolism of β-alanine in insects.

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Registro:
Título : Catecolamina - beta alanil ligasa (cbal), enzima clave en el metabolismo de neurotransmisores en los insectos     =    Cathecholamine-beta-alanyl ligase (CBAL), a key enzyme in the metabolsim of neurotransmitters in insects
Autor : Pérez, Martín Mariano
Director : Quesada Allué, Luis Alberto
Año : 2004
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires (IIBBA)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3736_Perez
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Biológica
Biología / Fisiología Animal
Biología / Genética
Palabras claves : CERATITIS CAPITATA; INSECTOS; METAMORFOSIS; ESCLEROTIZACION; AMINAS BIOGENICAS; CATECOLAMINA-BETA-ALANIL LIGASA (CBAL); NBAD-SINTETASA; SISTEMA NERVIOSO; RESPUESTA INMUNE; MUTANTES MELANICOS; CERATITIS CAPITATA; INSECTS; METAMORPHOSIS; SCLEROTIZATION; BIOGENIC AMINES; CATECHOLAMINE-BETA-ALANYL-LIGASE (CBAL); NBAD-SYNTHASE; NERVOUS SYSTEM; IMMUNE RESPONSE; MELANIC MUTANTS
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