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Ver el documento (formato PDF)   Edreira, Martín Miguel.  "Influencia de la fosforilación dependiente de PKA sobre la conformación y función de la GTPasa Rap 1b"  (2009-10-09)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La activación de Rap1b por la proteína de intercambio activada por AMPc (Epac) y su fosforilación mediada por la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA), son requeridas para la mitogénesis dependiente de AMPc. Sin embargo, el rol de la fosforilación permanece incierto. Evaluamos potenciales cambios conformacionales inducidos por la fosforilación de Rap1b, utilizando el intercambio hidrogeno/deuterio acoplado a espectroscopia de masa (DXMS) y cristalografía. Velocidades de intercambio hidrogeno/deuterio para Rap1b fosforilada (Rap1-P) y fosfomimética (Rap1-D) mostraron un perfil de intercambio idéntico, con velocidades incrementadas en regiones discretas a lo largo de la proteína, incluyendo un dominio alrededor del sitio de fosforilación y la región efectora. La estructura cristalina de Rap1b-G12V-S179D mostró que la presencia del S179D induce cambios en la interfase con los switch I y II. Nuestro segundo objetivo fue la búsqueda de efectores de Rap1b modulados por fosforilación. Entre los clones aislados por doble hibrido, se encontró la proteína asociada a la adenilil ciclasa 1 (CAP1). Rap y CAP presentaron una asociación independiente del nucleótido, pero dependiente de la isoprenilación de Rap1b. Aunque la fosforilación demostró modular negativamente esta interacción, su efecto sobre la señal mitogénica mediada por Rap1 fue positivo. CAP1, actuando como proteína andamio de Rap, resultó necesaria para la acción de Rap1, siendo requerida además para su activación y fosforilación, efecto que estaría mediado por la estimulación del aumento de los niveles de AMPc.

Abstract:
Activation of Rap1b by the exchange protein activated by cAMP (Epac) and its cAMPdependent protein kinase (PKA)-mediated phosphorylation are required for cAMP dependent mitogenesis. However, the role of phosphorylation remains unknown. We assessed potential conformational changes induced by phosphorylation of Rap1b using the amide hydrogen/deuterium exchange mass spectroscopy (DXMS) and Crystallography. Exchange rates PKA-phosphorylated (Rap1-P) and phosphomimetic (Rap1-D) Rap1b proteins showed the same pattern of exchange, revealing an increased exchange rate in discrete regions along the protein, including a domain around the phosphorylation site and the effector domain. Crystal structure for the full length Rap1b-G12V-S179D showed that the presence of the S179D induce changes at the interface with switch I and II. Our second objective was finding Rap1b effectors modulated in a phospho-dependent fashion.. Within the clones isolated by Two Hybrid, we found the adenylate cyclase-associated protein 1 (CAP1). Rap/CAP association showed to be nucleotide independent, but dependent on Raps’ isoprenylation. Although, phosphorylation showed to negatively modulate this interaction, it had positive effect on the mitogenic signal mediated by Rap1. CAP, acting as a scaffolding protein for Rap1b, was necessary for Rap1 mediated action, and required for Rap1b activation and phosphorylation, effect mediated by stimulating the increase of the levels of cAMP.

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Registro:
Título : Influencia de la fosforilación dependiente de PKA sobre la conformación y función de la GTPasa Rap 1b     =    Influence of PKA-dependent phosphorylation on the conformation and function of the GTPase Rap 1b
Autor : Edreira, Martín Miguel
Director : Altschuler, Daniel L.
Consejero : Muschietti, Jorge
Jurados : Calvo, J.  ; Cánepa, E.  ; Juri Ayub, M.
Año : 2009-10-09
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
University of Pittsburgh. School of Medicine. Department of Pharmacology and Chemical Biology
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_4544_Edreira
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : AMPC; PKA; FOSFORILACION; EPAC; RAP 1B; ALOSTERIC EFFECT; CAP1; CAMP; PKA; PHOSPHORYLATION; EPAC; RAP 1B; ALOSTERIC EFFECT; CAP1
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