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Ver el documento (formato PDF)   Llorente, Briardo Ernesto.  "Un rol biológico propuesto para las misteriosas polifenol oxidasas vegetales"  (2010)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Las polifenol oxidasas son ciertamente enzimas muy intrigantes. A pesar de haber sido estudiadas durante décadas y ser sus reacciones catalíticas ampliamente conocidas, no ha sido posible asignarles una localización precisa dentro de ninguna ruta metabólica. Aún más notable es que, incluso luego de más de 110 años de investigación transcurridos desde su descripción inicial en 1896, su función biológica es todavía un misterio. Las PPO son enzimas plastídicas ubicuas en vegetales que catalizan la conversión oxígeno-dependiente de fenoles a quinonas. Los sustratos fenólicos de PPO se localizan en la vacuola y entran en contacto con la misma cuando se producen daños en la compartimentación intracelular. Las quinonas formadas por la actividad de PPO son especies altamente reactivas, capaces de reaccionar con virtualmente todos los componentes celulares. Estas conducen a la formación y precipitación de polímeros oscuros similares a la melanina, un fenómeno conocido con el nombre de pardeamiento enzimático. Este fenómeno es responsable de cuantiosas pérdidas económicas en el mercado de frutos y vegetales y, actualmente, sólo puede ser parcialmente controlado mediante el uso de aditivos potencialmente dañinos para la salud humana. Con el propósito de contribuir al entendimiento del rol biológico y la evolución de estas enzimas, y a su vez generar un cultivo exento del deterioro oxidativo mediado por PPO, diversas líneas transgénicas (-PPO) de papa (Solanum tuberosum) con reducida actividad PPO fueron obtenidas mediante ingeniería genética y caracterizadas tanto a nivel fisiológico como molecular. El cultivo de papa fue elegido como modelo para este trabajo por ser el tercer cultivo de mayor consumo en el mundo y una de las alternativas principales para suplir las próximas necesidades alimentarias de la creciente población mundial. Considerando la relevancia intelectual y económica de estas enzimas, esta tesis trata tanto con aspectos biológicos como prácticos del estudio de las PPO. Un exhaustivo análisis de seguridad reveló que las papas -PPO son seguras para el consumo, si bien son metabólicamente diferentes a sus parentales silvestres (WT, de sus siglas en ingles Wild Type). Este estudio instauró el debate sobre la relevancia de los conceptos actualmente utilizados para la evaluación de la seguridad de cultivos transgénicos. En esta línea, diversos estudios sensoriales realizados en ratones y humanos revelaron que, además de su vida útil más prolongada, los tubérculos -PPO poseen mejoras organolépticas. Esta serie de estudios representaron el primer ejemplo exitoso de la aplicación de un modelo animal y paradigmas neurobiológicos en el estudio de un cultivo genéticamente modificado. Paralelamente, experimentos con patógenos e insectos fueron llevados a cabo para explorar las potenciales implicancias de PPO en los procesos de resistencia a estrés biótico. El desarrollo de un nuevo método para estudiar la enfermedad más devastadora del cultivo de papa, el tizón tardío, causado por el oomiceto Phytophthora infestans, permitió identificar que las plantas -PPO son más resistentes a este patógeno mediante mecanismos que parecen involucrar la participación de compuestos fenólicos. Inversamente, experimentos realizados con el insecto plaga Cyclocephala signaticollis mostraron que los tubérculos -PPO eran consumidos en una mayor proporción que los tubérculos WT por este coleóptero. A su vez, los análisis filogenéticos sugieren que las PPO vegetales fueron adquiridas por transferencia génica horizontal a partir de bacterias como una adaptación de las plantas primitivas al ambiente terrestre. En conjunto, estos estudios añaden una pequeña pero importante contribución a la comprensión de la evolución y la función biológica de las enzimas PPO que podría ser útil para el futuro desarrollo de nuevos cultivos mejorados. Finalmente, y probablemente el aspecto más interesante de esta tesis, es que, de la síntesis de los experimentos realizados durante el transcurso de este estudio, ha emergido una hipótesis que propone por primera vez una sugestiva explicación sobre el rol biológico de las PPO vegetales como parte de un sistema de defensa contra la depredación. El modelo propuesto aporta una explicación para el mecanismo de acción de PPO que es coherente con las evidencias evolutivas y, a su vez, permite interpretar una serie de intrigantes resultados previamente reportados por otros grupos de investigación.

Abstract:
The polyphenol oxidases are certainly very intriguing enzymes. Despite having been studied for decades and their catalytic reactions are well known, no precise location has been assigned to this enzyme in any known metabolic pathway. Remarkably, even after over 110 years of research since its initial description in 1896, its biological function is still a mystery. The PPOs are ubiquitous plastid plant enzymes that catalyze the oxygen-dependent conversion of phenols to quinones. PPO phenolic substrates are located in the vacuole and come into contact with the enzyme when disruption of the intracellular compartmentalization takes place. The quinones formed by PPO activity are highly reactive species that can react with virtually all cellular components, leading to the formation and precipitation of dark melanin-like polymers, a phenomenon known as enzymatic browning. This phenomenon is responsible for enormous economic losses in the fruit and vegetable industry and is currently partially controlled through the use of additives which have some adverse effects on human health. In an attempt to contribute to the understanding of the biological function and evolution of these enzymes, and to generate a quality improved crop exempt from the PPO-mediated oxidative damage, several transgenic potato (Solanum tuberosum) lines (-PPO or nonbrowning) with reduced PPO activity were genetically engineered and characterized both at the physiological and molecular levels. Potato was chosen as a model for this study because it is currently the third most important food crop consumed worldwide and a critical alternative for feeding the world’s growing population. Considering the intellectual and economic relevance of these enzymes, this thesis deals with both biological and practical aspects of the study of PPO. A comprehensive evaluation of the safety assessment of the transgenic lines revealed that the nonbrowning potatoes present no risk for adverse health effects. Although, they are metabolically different from wild-type (WT) potatoes. An exhausted safety assessment analysis evidenced no adverce health effects, establishing a debate about the relevance of the concepts currently used to assess the safety of genetically modified crops. In line with these aspects, sensory studies in mice and humans revealed that, in addittion to their extended shelf life, nonbrowning potatos have organoleptic improvements over the WT potatos. This series of studies represented the first successful example of the implementation of an animal model and neurobiological paradigms in the study of a genetically modified crop. In parallel, studies with pathogens and insects were carried out to study the potential implications of PPO in biotic stress resistance processes. A new method to study the most devastating disease affecting potato, the “late blight”, caused by the oomycete Phytophthora infestans, was developed and applied to evaluate the disease resistance of -PPO plants. The transgenic plants presented an increased resistance to this pathogen through mechanisms that seem to involve the participation of phenolic compounds. Conversely, experiments performed with the insect pest Cyclocephala signaticollis showed that -PPO tubers were consumed in greater proportions than WT tubers by this coleopteran. In turn, phylogenetic analyses suggests that plant PPOs were acquired by horizontal gene transfer from bacteria as an adaptation of primitive plants to the terrestrial environment. In summary, these studies provide a small but important contribution to the understanding of the evolution and biological function of PPO enzymes that could be useful for the future development of new improved crops. Finally, and perhaps the most interesting and relevant aspect of this thesis, is that a new hypothesis that provides an suggestive explanation for the biological role of plant PPOs as part of a defense system against predation has emerged from the work done. The proposed model provides an explanation for the mechanism of action of PPO that, is consistent with the evolutionary evidence, and also allows to interpret a number of intriguing results previously reported by other research groups.

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Registro:
Título : Un rol biológico propuesto para las misteriosas polifenol oxidasas vegetales     =    A proposed biological role for the mysterious plant polyphenol oxidases
Autor : Llorente, Briardo Ernesto
Director : Flawiá, Mirtha María
Director Asistente : Bravo-Almonacid, Fernando Félix
Consejero : Quesada Allué, Luis
Jurados : Yanovsky, M.  ; Hopp, E.  ; Romano, A.
Año : 2010
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_4789_Llorente
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Biológica
Biología / Bioquímica
Palabras claves : POLIFENOL OXIDASAS (PPO); ROL BIOLOGICO DE PPO; EVOLUCION DE PPO; OXIDACION ENZIMATICA; MEJORAMIENTO BIOTECNOLOGICO; SOLANUM TUBEROSUM; ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO (OGM); SEGURIDAD DE OGMS; PERCEPCION DE OGMS; SILENCIAMIENTO GENICO; TOLERANCIA A ESTRES; POLYPHENOL OXIDASE(PPO); PPO BIOLOGICAL FUNCTION; PPO EVOLUTION; ENZYMATIC BROWNING; BIOTECH IMPROVEMENT; SOLANUM TUBEROSUM; GENETICALLY MODIFIED ORGANISM (GMO); GMO SAFETY ASSESSMENT; GMO PERSEPTION; GENE SILENCING; STRESS TOLERANCE
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