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Ver el documento (formato PDF)   Lentz, Ezequiel Matías.  "Producción de antígenos y anticuerpos de interés veterinario en plantas transplastómicas de tabaco"  (2011)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
En esta Tesis Doctoral, se evaluó la factibilidad de utilizar plantas transplastómicas de tabaco (Nicotiana tabacum) para la producción de proteínas de interés en medicina veterinaria: dos antígenos virales y un anticuerpo de camélido de cadena simple (VHH). La primera proteína producida en este sistema consistió en una fusión entre un epítope inmunogénico de la proteina VP1 del virus de la fiebre aftosa y la enzima β-glucuronidasa (VP-βGUS). Se generaron plantas transplastómicas, las cuales fueron caracterizadas a nivel molecular. La proteína heteróloga se acumuló de un modo importante en los cloroplastos de las plantas transformadas: hasta el 51% de las proteínas solubles totales (PST) (8 mg/g de tejido fresco ), conservando su actividad enzimática e inmunogenicidad. Los niveles de expresión observados resultaron claramente mayores a los obtenidos previamente en plantas transgénicas nucleares utilizando la misma construcción. A pesar de estos altos niveles de expresión, el fenotipo de las plantas transplastómicas resultó ser indistinguible del de las plantas wild-type. Esta prueba de concepto con resultados alentadores nos permitió avanzar en la producción de otras moléculas mediante este sistema. El segundo antígeno expresado fue VP8*, una proteína no glicosilada de la cápside de rotavirus bovino (RVB). Se utilizó una versión del vector que permite la acumulación de VP8* en el estroma y se generaron dos construcciones adicionales, una para expresarla como una fusión a la β-glucuronidasa (GUS-E-VP8*), y otra para dirigirla al lúmen de los tilacoides (str- VP8*). VP8* se acumuló como agregados insolubles en el estroma de los cloroplastos y pudo ser solubilizada parcialmente por sonicación. Se obtuvieron extractos de VP8* utilizando la fracción soluble, donde VP8* representaba el 4% de las PST (250 μg/g TF). Al extraerse VP8* a partir de la fracción insoluble sin incluir el paso de sonicación, fue posible enriquecer la preparación en la proteína recombinante, eliminar la nicotina, y mejorar el rendimiento al obtenerse 500 μg/g TF. La proteína VP8* obtenida a partir de ambas fracciones resultó ser inmunogénica y protectiva contra el virus en el modelo del ratón lactante. Las estrategias alternativas para la expresión de VP8* no fueron exitosas. GUS-E-VP8* se acumuló como una proteína soluble en el estroma del cloroplasto, pero en niveles significativamente menores que VP8*. La construcción str-VP8* permitió la translocación de VP8* al lúmen de los tilacoides, pero se observó una proteólisis no esperada de la proteína, y la presencia de una forma truncada de la misma. Estos resultados sugieren que la acumulación de VP8* en el estroma del cloroplasto es favorecida por su insolubilidad, que la protegería del ataque proteolítico. La tercera molécula expresada fue el VHH clon 3B2 dirigido contra un epítope conformacional de la proteína VP6 de RVB. Para la expresión de este nanoanticuerpo también se evaluaron tres estrategias: expresión de VHH en el estroma, redirección al lúmen de los tilacoides (pep- VHH) y fusión a la enzima β-glucuronidasa (GUS-E-VHH). Todas las líneas de plantas transplastómicas expresando VHH mostraron un fenotipo heteroplástico. El análisis molecular confirmó la heteroplastía en líneas que habían sido regeneradas en medio selectivo al menos tres veces. La proteína VHH se acumuló en niveles bajos, los cuales se acercaban al límite de la detección por la técnica de western blot. La expresión se mejoró significativamente tanto en las plantas pep-VHH (2,5% de las PST; 60 μg/g TF) como en las GUS-E-VHH (3% de las PST; 70 μg/g TF), aunque en este último caso se observaron productos de degradación. Las plantas pep-VHH homoplásticas tenían un fenotipo clorótico que se intensificaba con la mayor iluminación. Los resultados obtenidos muestran la dificultad de expresar este VHH en cloroplastos y sugieren un efecto tóxico del transgén. La redirección al lúmen de los tilacoides favorecería la estabilidad de esta proteína heteróloga, lo cual es consistente con su expresión exitosa en E. coli cuando se expresa en el periplasma bacteriano. Los resultados presentados en este trabajo aportan evidencias que promueven el uso y optimización de plantas transplastómicas como biorreactores, para llegar a ser alternativas rentables y concretas de uso en la industria.

Abstract:
In this PhD Thesis, we evaluated the feasibility of using transplastomic plants (Nicotiana tabacum) for the production of proteins of interest in veterinary medicine: two viral antigens and a camelid single-chain antibody (VHH). The first protein produced in this system was a translational fusion of an immunogenic peptide from VP1 of foot-and-mouth disease virus and the enzime β-glucuronidase (VP-βGUS). Transplastomic plants engineered to express the aforementioned construction were characterized at the molecular level. The heterologous protein accumulated up to 51% of the total soluble leaf protein (TSP), or 8 mg/g of fresh tissue (FT), while retaining its enzymatic activity and immunogenicity. The observed expression levels were clearly higher than those obtained previously in nuclear transgenic plants, using the same construction. Despite these high levels of expression, the phenotype of the transplastomic plants was indistinguishable from that of wild-type plants. This proof of concept with encouraging results, allowed us to continue evaluating this system for the production of other recombinant proteins. The second antigen expressed was VP8*, a non-glycosilated capside protein from bovine rotavirus (BRV). Two additional constructions were used to express it in the chloroplast stroma as a β-glucuronidase fusion (GUS-E-VP8*), and to accumulate it in the thylakoid lumen (str- VP8*). VP8* formed insoluble aggregates in the stroma and was partially solubilized by sonication. In the soluble extracts obtained from VP8* transplastomic plants, the recombinant protein represented 4% of the TSP (250 μg/g FT). The insoluble fraction from these plants was highly enriched in VP8*, devoid of nicotine, and contained 500 μg/g FT. The protein from both fractions was immunogenic and conferred protection against the virus in the suckling mouse model. The alternative strategies for VP8* expression were unsuccessful. GUS-E-VP8* accumulated as a soluble protein at barely detectable levels. The construction str-VP8* allowed translocation of VP8* into the thylakoid lumen, but the protein was processed in an unexpected manner. These results suggest that VP8* accumulation in the chloroplast stroma is boosted by its insolubility, which would protect the recombinant protein from proteolytic attack and degradation. The third molecule expressed was the VHH clone 3B2 directed against a conformational epitope of the VP6, an inner capsid protein of BVR. This nanobody was expressed using three strategies: accumulation in the stroma by itself (VHH) or as a fusion to the β-glucuronidase (GUS-E-VHH), and translocation into the thylakoid lumen (pep-VHH). All the transplastomic lines expressing the single-chain antibody presented an heteroplastic phenotype. Southern blot analysis confirmed the heteroplasmy of these plants. In VHH transplastomic plants the protein accumulated at very low levels, almost undetectable by western blot. Expression levels were improved in both pep-VHH (2,5% of TSP; 60 μg/g TF) and GUS-E-VHH plants (3 % of TSP; 70 μg/g TF), but in the latter case degradation products were observed. Homoplastic pep-VHH plants had a chlorotic phenotype, which was more intense when the plants were grown with higher illumination. These results show the difficulty of expressing this VHH in chloroplasts and suggest a toxic effect of the transgen on the plant. The redirection to the lumen of thylakoids favors the stability of the heterologous protein, which is consistent with its successful expression in E. coli when it is directed to the bacterial periplasm. The results presented in this work support the use and optimization of transplastomic plants as biorreactors, in order to become concrete industrial alternatives.

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Registro:
Título : Producción de antígenos y anticuerpos de interés veterinario en plantas transplastómicas de tabaco     =    Production of antigens and antibodies of veterinary interest in tobacco transplastomic plants
Autor : Lentz, Ezequiel Matías
Director : Bravo-Almonacid, Fernando Félix
Director Asistente : Wigdorovitz, Andrés
Consejero : Prometeo Muschietti, Jorge
Jurados : Hopp, Horacio Esteban  ; Taboga, Oscar Alberto  ; Asurmendi, Sebastián
Año : 2011
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_4885_Lentz
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Agrobiotecnología
Biología / Ingeniería Genética
Biología / Inmunología
Palabras claves : PLANTAS TRANSPLASTOMICAS; BIORREACTORES; NICOTIANA TABACUM; ANTIGENOS; FIEBRE AFTOSA; ROTAVIRUS BOVINO; VHH; TRANSPLASTOMIC PLANTS; MOLECULAR FARMING; NICOTIANA TABACUM; ANTIGENS; FOOT AND MOUTH DISEASE VIRUS; BOVINE ROTAVIRUS; VHH
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