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Ver el documento (formato PDF)   Linero, Florencia N..  "Estrategia de reprogramación traduccional del virus Junín en infecciones in vitro: estudio de las principales vías de regulación del inicio de la traducción"  (2011)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Dentro de los factores que determinan el éxito de una infección viral la eficiencia en la traducción de las proteínas del virus constituye un factor clave a la hora de definir tanto la citopatogenicidad como la virulencia de estos agentes. Los virus son parásitos intracelulares obligados, por lo cual dependen completamente de la maquinaria traduccional de la célula hospedadora para sintetizar sus proteínas. Esta dependencia los ha llevado a desarrollar distintas estrategias de reprogramación traduccional a fin de asegurar la competencia efectiva de sus mARNs con los mARNs celulares por la maquinaria de traducción. En este trabajo de tesis doctoral se analizó la estrategia de reprogramación traduccional utilizada por el virus Junín (JUNV) para lograr la traducción de sus mARNs. El estudio se centró fundamentalmente en el proceso de inicio de la traducción, evaluándose la participación del complejo eIF (eIF4E, eIF4A y eIF4GI) y del factor eIF2 y la modulación de sus principales mecanismos de regulación. En este trabajo se demostró que JUNV es capaz de traducir las proteínas virales aún en ausencia del factor de unión al cap, eIF4E, a pesar de que sus mRNAs presentan dichas estructuras en sus extremos 5´. Esto fue comprobado mediante el empleo de inhibidores de la vía de PI3K/Akt/mTOR, principal vía regulatoria de la traducción dependiente del cap, observándose que la inhibición de PI3K posterior a la entrada del virus no tuvo efectos significativos en la replicación de JUNV. Estos resultados fueron corroborados mediante el tratamiento con la droga rapamicina, un inhibidor del complejo mTOR/raptor, la cual no afectó la síntesis de antígenos virales. La expresión de una proteína dominante negativa de 4E-BP, proteína reguladora de eIF4E, tampoco afectó la replicación de JUNV, reforzando la idea de que el factor eIF4E no sería necesario en la replicación de JUNV. Asimismo, la inhibición de la vía de PI3K/Akt en un cultivo persistentemente infectado con JUNV tampoco afectó la síntesis de los antígenos virales. Por otro lado, se demostró un bloqueo en la fosforilación de eIF2α ejercido por JUNV. La fosforilación de este factor constituye uno de los principales mecanismos de la respuesta celular antiviral, mediante el cual la célula induce el bloqueo global de la traducción con el fin de impedir la replicación viral. La consecuencia de esta fosforilación es el secuestro de los factores de inicio de la traducción en estructuras citoplasmáticas denominadas gránulos de estrés (SGs). Los resultados obtenidos demostraron que el bloqueo en la fosforilación de eIF2α inducido por JUNV inhibe la formación de SGs cuando las células infectadas son tratadas con un inductor de estrés oxidativo. Este impedimento sería mediado fundamentalmente por la expresión de los antígenos virales N y GPC y tendría por finalidad mantener activo al factor eIF2 como así también asegurar el acceso a los factores de inicio de la traducción, que de otra manera podrían quedar secuestrados en los SGs. Esta modulación de la respuesta a la estrés celular no fue observada en los cultivos persistentemente infectados con JUNV, indicando que la ausencia de expresión de G1 y probablemente los bajos niveles de la proteína N en su forma completa serían responsables de que estos cultivos persistentemente infectados no logren bloquear la respuesta celular al estrés. Por otro lado, se demostró el requerimiento de los factores de inicio de la traducción del complejo eIF: eIF4A y eIF4G, mediante ensayos de silenciamiento y el empleo de inhibidores específicos, indicando una estrategia de traducción alternativa en la cual la participación de eIF4E, integrante canónico de dicho complejo, no sería requerida. Probablemente la participación de una proteína viral en reemplazo del factor de unión al cap eIF4E, favorecería la traducción de los mARNs de JUNV, sin inducir un bloqueo en la síntesis de las proteínas celulares. La interacción de N con los factores eIF4A y eIF4GI, evaluada mediante ensayos de inmunoprecipitación y microscopía confocal, sugiere que esta proteína viral estaría formando parte de los complejos de traducción de los mARNs virales. En función de los resultados expuestos se plantea un modelo de reprogramación traduccional para JUNV en el cual el factor de unión al cap, eIF4E, no sería mayoritariamente requerido para la traducción de los antígenos virales. La actividad de este factor sería reemplazada por la proteína N que mediante su interacción con los factores eIF4A y eIF4GI constituiría los complejos de traducción del virus. Sin embargo, no puede descartarse la participación de eIF4E en la traducción inicial de los mARNs de N, hasta que los niveles de esta proteína puedan competir efectivamente con dicho factor.

Abstract:
Translation efficiency of viral proteins is a key factor in defining both cytopathogenicity and virulence of viruses, which are obligate intracellular parasites and entirely dependent on the cellular translational machinery to synthesize their proteins. This dependence has led them to develop different strategies of translational reprogramming to ensure effective competition of viral mRNAs with cellular mRNAs. In this doctoral thesis the translational reprogramming strategy used by Junin virus (JUNV) to achieve the translation of its mRNAs, was analyzed. The study was focused primarily on the process of translation initiation, to evaluate the involvement of eIF complex (eIF4E, eIF4A and eIF4GI) and the eIF2 factor and the modulation of main regulatory mechanisms. Results suggest that JUNV might be able to translate viral proteins even in the absence of the cap-binding factor, eIF4E, although its mRNAs have cap structures in their 5 'ends. This is supported by the fact that inhibitors of PI3K/Akt/mTOR pathway, the main regulatory pathway of capdependent translation were effective only during virus entry but not on JUNV protein translation. Treatment of infected cells with rapamycin, an mTOR complex/raptor inhibitor and the expression of a dominant negative protein 4E-BP, eIF4E regulatory protein, had no effect on JUNV replication, reinforcing the idea that the eIF4E factor would not be required for JUNV replication. Furthermore, inhibition of PI3K/Akt pathway in a JUNV persistently infected culture did not affect the synthesis of viral antigens. On the other hand, a blockage on the eIF2α phosphorylation exerted by JUNV was observed. Phosphorylation of this factor is one of the main mechanisms of the antiviral cellular response, by which cell induces a global translation blockade to prevent viral replication. The consequence of this phosphorylation is the sequestering of the initiation translation factors in cytoplasmic structures named stress granules (SGs). The results showed that blockage in the phosphorylation of eIF2α induced by JUNV inhibits the formation of SGs when infected cells are treated with an oxidative stress inductor. This blockage would be mediated primarily by the expression of viral antigens N and GPC and would aim to keep eIF2 factor active to ensure virus access to initiation translation factors which might otherwise be sequestered into SGs. This modulation on the cellular stress response was not observed in cultures persistently infected with JUNV, indicating that the absence of expression of G1 and probably low levels of the complete form of N protein would be responsible for these persistently infected cultures inability to block the cellular stress response. Requirement of initiation translation complex eIF: eIF4A and eIF4G has been assessed by ARN interfering assays and the use of specific inhibitors. Results indicate an alternative translation strategy in which the involvement of eIF4E, a canon member of this complex would not be required. Probably, the involvement of a viral protein to replace the cap binding factor eIF4E, would favor the translation of JUNV mRNAs without inducing a blockage in cellular proteins synthesis. N interaction with eIF4A and eIF4GI factors was assessed by immunoprecipitation assays and confocal microscopy suggesting that this viral protein would be part of the translation complex of viral mRNAs. Based on the above results a model for JUNV translational reprogramming is presented. In this model, the cap-binding factor, eIF4E, would be replaced by N protein through its interaction with eIF4A and eIF4GI factors constituting the translation complex for viral proteins. However, it cannot be ruled out the involvement of eIF4E at the initial translation step of N mRNA, until the level of this protein can be high enough to compete effectively with this factor.

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Registro:
Título : Estrategia de reprogramación traduccional del virus Junín en infecciones in vitro: estudio de las principales vías de regulación del inicio de la traducción     =    Junin virus translational reprogramming strategy: study of the main regulation pathways during initiation of translation
Autor : Linero, Florencia N.
Director : Scolaro, Luis Alberto
Consejero : Damonte, Elsa Beatriz
Jurados : Rossi, Silvia  ; Mbayed, Viviana Andrea  ; Taboga, Oscar Alberto
Año : 2011
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Virología
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_4956_Linero
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Genética
Biología / Virología
Palabras claves : VIRUS JUNIN; NUCLEOPROTEINA; TRADUCCION; ELF4E; ELF4A; ELF4G; ELF2; GRANULOS DE ESTRES; JUNIN VIRUS; NUCLEOPROTEIN; TRANSLATION; ELF4E; ELF4A; ELF4G; ELF2; STRESS GRANULES
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