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Ver el documento (formato PDF)   Galello, Fiorella Ariadna.  "Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependiente de cAMP: proteínas sustrato y de anclaje de PKA de Saccharomyces cerevisiae"  (2011)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La especificidad en la vía de transducción de señales de cAMP-PKA está determinada por el reconocimiento de la secuencia blanco en el sustrato y por la localización de la quinasa en compartimentos subcelulares. En Saccharomyces cerevisiae los determinantes de la especificidad de la proteína quinasa A (PKA) están menos caracterizados que en mamíferos. Analizamos el comportamiento de los sustratos y los determinantes de secuencia alrededor del sitio de fosforilación de tres proteínas sustrato: Piruvato quinasa 1 (Pyk1), Piruvato quinasa 2 (Pyk2) y Trehalasa neutra (Nth1). La proteína Nth1 es mejor sustrato que la proteína Pyk1 y ambas son fosforiladas tanto por Tpk1 como por Tpk2, dos de las isoformas de la subunidad catalítica de la PKA de levaduras. Las tres proteínas contienen uno o más motivos consenso de PKA, Arg-Arg-X-Ser, pero no todos ellos son fosforilados. Análisis de esos sitios permitieron determinar que los residuos ácidos en la posición P+1 o en el extremo N-terminal son deletéreos para la reacción catalítica, mientras que los residuos positivos presentes más allá de las posiciones P-2 y P-3 la favorecen. Un residuo hidrofóbico voluminoso en posición P+1 no resulta crítico, a diferencia de lo que ocurre con los sustratos de la PKA de mamíferos. El mejor sustrato tiene en la posición P+4 un residuo ácido, equivalente al que se encuentra en la secuencia inhibitoria de Bcy1, la subunidad regulatoria de la PKA de levaduras. Se analizó también el efecto del sustrato sobre la activación de la holoenzima y demostramos que tanto los sustratos peptídicos como las proteínas enteras sensibilizan en diferentes grados, dependiendo de sus secuencias, a la holoenzima para la activación por cAMP. Los resultados también sugieren que las proteínas enteras son mejores co-activadores que los péptidos. Se determinaron los catalitic turnover numbers de las isoformas Tpk1 y Tpk2, y ambas enzimas mostraron el mismo valor, 3 seg-1, diez veces menor que el valor determinado para las subunidades C de mamíferos. La compartimentalización de la señal del cAMP, otro punto de regulación de la especificidad, es mantenida por el agrupamiento de las enzimas de la vía de señalización en unidades discretas a través de las proteínas de anclaje de la proteína quinasa A (AKAPs), las cuales interactúan con la subunidad regulatoria de la holoenzima. Hasta el momento no habían sido identificadas proteínas de anclaje en levaduras. Definimos, utilizando abordajes in silico y bioquímicos de copurificación e identificación por espectrometría de masa, proteínas que hacen interacción con Bcy1, entre ellas: GTPase activating protein 2 (Ira2), Myosin2 (Myo2), Heat shock protein 60 (Hsp60) and Protein Tyrosine Phosphatase 1 (Ptp1). Utilizando arrays de péptidos se identificaron los residuos críticos para la interacción en las proteínas de anclaje. Los dominios definidos como claves de la interacción presentan una estructura posible de α-hélice con residuos cargados positivamente que son importantes para la interacción. Usando mutantes de deleción se definió que las proteínas estudiadas hacen interacción con la región N-terminal de Bcy1. Se verificó la interacción in vitro por ensayos de pull-down, e in vivo por inmunoprecipitación. También se demostró que Bcy1 e Ira2 localizan en la misma fracción subcelular y que péptidos derivados de Ira2 son fosforilados por las Tpks in vitro. Se analizó la relevancia fisiológica de la interacción entre Bcy1 y Hsp60 y se observó que la actividad quinasa de PKA disminuye en ausencia de la chaperona, indicando que la Hsp60 tendría una función estabilizadora sobre las Tpks y además que frente a un estrés térmico Bcy1, Tpk1 y Hsp60 aumentan su localización en la fracción mitocondrial, lo que permitiría modular el transporte de proteínas mitocondriales por fosforilación

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Registro:
Título : Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependiente de cAMP: proteínas sustrato y de anclaje de PKA de Saccharomyces cerevisiae     =    Activation mechanism
Autor : Galello, Fiorella Ariadna
Director : Rossi, Silvia Graciela
Consejero : Moreno de Colonna, Silvia Margarita
Jurados : Podestá, Ernesto  ; Lagares, Antonio  ; Turjanski, Adrián
Año : 2011
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_4985_Galello
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Biológica
Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : PKA; CAMP; SACCHAROMYCES CEREVISIAE; BCY1; SUSTRATOS; AKAPS; PKA; CAMP; SACCHAROMYCES CEREVISIAE; BCY1; SUBSTRATES; AKAPS
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