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Ver el documento (formato PDF)   Mateu, Cecilia Gabriela.  "Polisacáridos y variantes del virus Herpes simplex como herramienta en el esclarecimiento de la patogenia viral"  (2011-12-16)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Los carragenanos (CGNs), galactanos sulfatados aislados de algas rojas, han sido identificados como potentes inhibidores del virus Herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2) afectando principalmente la adsorción de HSV a la célula, etapa inicial del ciclo viral. Dado que presentan una similitud estructural con el heparan sulfato (HS), receptor celular que media la adsorción de HSV a la célula, actúan bloqueando la interacción virus-HS, en la que participan glicoproteínas de la envoltura viral. En estudios previos se seleccionaron y caracterizaron variantes virales sinciciales (syn) de HSV-1 (F) por pasajes sucesivos del virus en células Vero en presencia de un CGN natural 1C3 (de estructura relacionada con CGNs Iota (ι) y Kappa (κ)) con el fin de evaluar la capacidad de los CGNs de generar variantes virales resistentes durante el proceso de selección. En el presente trabajo se profundizó el estudio de la caracterización citopática y patogénica de las variantes 1C314-1 y 1C317-2. Las variantes mostraron un bajo nivel de resistencia a 1C3, heparina, aciclovir (ACV) y foscarnet (PFA). Las mismas resultaron avirulentas en ratones BALB/c infectados por vía intravaginal respecto de la cepa patrón que mostró alta mortalidad. La atenuación se correlacionó con bajos niveles de04:00 p.m. 22/12/2014 citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-6) en lavados vaginales, aunque el título viral fue similar al obtenido con la cepa patrón. Por vía intranasal las variantes mostraron una marcada virulencia en ratones BALB/c, conduciendo a una generalizada diseminación viral. En ratones C57BL/6 resultaron avirulentas empleando las mismas vías de infección. Para evaluar la capacidad de generar variantes atenuadas con otro serotipo de HSV empleando la misma estrategia usada con HSV-1, se realizaron pasajes seriados de HSV-2 cepa MS en células Vero en presencia de concentraciones crecientes de CGNs ι y κ. Se seleccionaron 4 clones, ι22-9, ι22-12, κ22-12 y κ22-13, los cuales mostraron tener fenotipo syn, leve resistencia a los CGNs y a la heparina, pero variable susceptibilidad al ACV y al PFA. Todos los clones fueron menos virulentos que la cepa patrón (100% mortalidad) particularmente para ratones C57BL/6 por inoculación intravaginal e intranasal. La atenuación de las variantes de HSV-2 se correlacionó con altos niveles de TNF-α e IL-6 en lavados vaginales, y la infectividad cuantificada en los mismos fue similar a la obtenida con la cepa parental. Las variantes mostraron una replicación similar a la cepa parental en células Vero. Sin embargo, en cultivos primarios de astrocitos murinos mostraron un menor rendimiento viral. Los estudios in vitro realizados, mostraron que los CGNs ι y κ estimulan la proliferación celular y la liberación de citoquinas en macrófagos murinos (RAW264.7). Sin embargo, inoculados en ratones BALB/c por vía intravenosa no lograron elevar los niveles de citoquinas séricas. El conjunto de estos resultados indica que el sistema inmune innato, especialmente en la regulación de los niveles de TNF-α e IL-6, juega un rol de importancia en la patología del virus herpes simplex y apunta a considerar la posibilidad que este tipo de variantes virales tanto de HSV-1 como de HSV-2 emerjan durante las terapias antivirales basadas en CGNs.

Abstract:
Natural carrageenans (CGNs), extracted from red seaweeds, are well known as potent and selective inhibitors of Herpes Simplex virus type 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2). They have a chemical structure similar to heparan sulfate (HS) that serves as a primary receptor for adsorption. Their mode of antiviral action is by interference with HSV attachment to cells, blocking the interaction virus-HS, involving viral glycoprotein‟s. In a previous work, viral variants of HSV-1 were obtained by successive passages on Vero cells under selective pressure with the CGN 1C3, (partially cyclized μ/v-carrageenan, related to ι and κ CGNs) in order to test the ability of the carrageenan to generate resistant variants during the selection process. In the present work, a more detailed study of the cytopathic and pathogenic behavior of HSV-1 syncytial (syn) variants 1C314-1 and 1C317-2 was carried out. The variants showed low levels of resistance to 1C3, heparin, Aciclovir (ACV), and Foscarnet (PFA). They also showed to be avirulent for BALB/c mice infected by intravaginal route, although the parental strain F was highly lethal. The attenuation of the variants was correlated with lower levels of proinflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) in vaginal lavages with respect to the parental strain, despite that viral titers were similar between the viral variants and the F strain. Nevertheless, the variants were highly lethal for BALB/c mice inoculated by the intranasal route, with a generalized organ spreading. To evaluate the capacity to generate attenuated variants using another HSV serotype employing the same strategy used before, 22 passages of HSV-2 (MS) were made on Vero cells with increasing amounts of κ or ι carrageenan. As a result of this, four clones were selected and named, ι22-9, ι22-12, κ22-12 and κ22-13. The clones showed a 100% syn phenotype, a mild resistance to CGNs and heparin and a variable susceptibility to ACV and PFA. All the clones were less virulent for mice intravaginal and intranasal inoculated, particularly for C57BL/6 strain, whereas MS strain produced 100% of mortality. In contrast to HSV-1 variants, the attenuation was correlated with high levels of pro-inflammatory cytokines (TNF-α y IL-6), on vaginal lavages. The variants of HSV-2 showed that although all of them grew equally on Vero cells, a partially restricted phenotype was observed when a primary culture of mouse astrocytes was employed. Finally, the CGNs were able to stimulate the proliferation of several cells lines and cytokines secretion in vitro but they did not showed this behavior on BALB/c mice inoculated by intravenous route. Taking all these results together, we can conclude that the innate immune system, specially TNF-α and IL-6 expression, plays an important role in the pathology of herpes simplex virus, and the possibility that this kind of HSV-1 and HSV-2 variants could emerge during an antiviral therapy for humans based on CGNs, must be considered.

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Registro:
Título : Polisacáridos y variantes del virus Herpes simplex como herramienta en el esclarecimiento de la patogenia viral     =    Polysaccharides and Herpes simplex virus variants as tools for the viral pathogeny elucidation
Autor : Mateu, Cecilia Gabriela
Director : Carlucci, María Josefina
Consejero : Damonte, Elsa Beatriz
Jurados : Candurra, Nélida  ; Barrero, Paola Roxana  ; Ávila de Efrón, María Mercedes
Año : 2011-12-16
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Virología
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5006_Mateu
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Virología
Palabras claves : VIRUS HERPES SIMPLEX; CARRAGENANOS; VARIANTES VIRALES; ATENUACION; SINCICIOS; HERPES SIMPLEX VIRUS; CARRAGEENAN; VIRAL VARIANTS; ATTENUATION; SYNCYTIUM
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