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Ver el documento (formato PDF)   Ogara, María Florencia.  "Mecanismo de activación de P191NK4d y su papel como factor neuroprotector frente a la injuria genotóxica"  (2012)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La permanencia de la mayoría de las neuronas durante toda la vida del organismo necesaria para mantener sus funciones, y el hecho de que estas células no se dividan luego del desarrollo sugieren que, durante la evolución, se ha ejercido una fuerte presión sobre el sistema nervioso de modo de desarrollar diversos mecanismos que lo protejan contra la muerte celular. Las dramáticas consecuencias de la neurodegeneración enfatizan la importancia de estos mecanismos que promueven la supervivencia y plasticidad neuronal. Por lo tanto, la identificación de los factores implicados en la regulación de la homeostasis y supervivencia neuronal es imprescindible para comprender el desarrollo y establecimiento de las enfermedades neurodegenerativas y para el diseño de una terapia racional para su tratamiento. La expresión temprana y extensa de p19INK4d, un miembro de la familia INK4 de inhibidores del ciclo celular, en el cerebro y su participación en la reparación del DNA y en la apoptosis sostienen la hipótesis de que esta proteína participaría en mecanismos de protección de las neuronas frente a la muerte celular. El objetivo del presente trabajo consistió en evaluar el potencial rol de p19 en este sentido, así como también su mecanismo de activación. Se utilizaron células SH-SY5Y diferenciadas con ácido trans-retinoico como modelo neuronal y cultivos primarios de neuronas hipocampales de rata. Los tratamientos con genotóxicos como el péptido β-amiloide o neocarzinostatina indujeron la expresión y fosforilación de la proteína de p19. Ambos efectos fueron dependientes de la movilización de calcio intracelular, ya que la incubación con el ionóforo de calcio A23187 o con una concentración aumentada de potasio, recapitularon la acción de los genotóxicos sobre p19. La inhibición de la actividad de CDK5 o la incubación con calpeptina, un inhibidor de la calpaína, responsable de la proteólisis de p35, subunidad regulatoria de CDK5, a p25, su forma más activa, causaron la inhibición de la fosforilación de p19 en respuesta a genotóxicos, demostrando que la quinasa CDK5 es la enzima efectora de dicha fosforilación. Se establecería un balance entre la síntesis y degradación de la proteína p19, ya que la misma parecería ser un sustrato de la calpaína, proteasa que se activa en presencia de los genotóxicos mencionados. Por otro lado, el factor de transcripción E2F1 participaría en la inducción de la expresión de p19 frente al péptido β-amiloide. Las células neuronales con sobrexpresión inducida de p19 repararon más eficientemente el DNA dañado y mostraron niveles reducidos de muerte celular en respuesta al tratamiento con el péptido β-amiloide o neocarzinostatina. Resultados opuestos se obtuvieron en células deficientes en esta proteína. La presencia de los genotóxicos también produjo la inducción del gen de p19 en neuronas de hipocampo. Estas células con niveles disminuidos de p19 presentaron una menor eficiencia en la reparación del DNA y un mayor grado de apoptosis luego del tratamiento con los genotóxicos. La presencia de p19 influenció la sensibilidad neuronal a largo plazo y confirió resistencia al estrés neurotóxico. Ensayos in vivo llevados a cabo en el hipocampo del ratón mostraron que en ausencia de p19 existía un mayor porcentaje de células dañadas luego de la inyección de neocarzinostatina. De esta forma, los resultados obtenidos en esta tesis nos permiten hablar de p19 como un factor neuroprotector, implicado no sólo en los mecanismos de reparación del DNA en respuesta al estrés genotóxico exógeno, sino también en la resistencia y en la supervivencia de las neuronas en respuesta a procesos endógenos que conducen a la neurodegeneración.

Abstract:
The permanence of most neurons throughout the life span of an organism is required to maintain its functions. The fact that these cells do not undergo division after the developmental stage suggests that, during evolution, the nervous system was subjected to a strong selective pressure to develop appropriate mechanisms to prevent cell death. The dramatic consequences of neurodegeneration highlight the importance of these mechanisms that promote neuron survival and plasticity. Therefore, the identification of the factors involved in the regulation of neuron homeostasis and survival is critical to understanding the development and progress of neurodegenerative diseases, as well as for the design of rational therapies for their treatment. p19INK4d, a member of the INK4 family of cell cycle inhibitors, is expressed in an early and long-lasting manner in the brain and is involved in DNA repair and apoptosis. This supports the hypothesis that this protein might participate in the mechanisms that protect neurons from cell death. The aim of this thesis was to examine a potential role for p19 in this context, as well as its mechanism of activation. SH-SY5Y cells differentiated with all-trans-retinoic acid and primary cultures of rat hippocampal neurons were used as neuronal models. Genotoxic stimuli such as the β- amyloid peptide and neocarzinostatin induced the expression and phosphorylation of the p19 protein. Both effects appear to depend on intracellular calcium mobilization since they were recapitulated by treatment with the calcium ionophore A23187 or high extracellular potassium levels. Inhibition of CDK5 activity or treatment with the calpain inhibitor calpeptin prevented p19 modification in response to genotoxic stress. The protease calpain cleaves p35, CDK5 regulatory subunit, to its more active form p25. These results indicate that CDK5 is the kinase responsible for p19 phosphorylation. An equilibrium between p19 synthesis and degradation likely exists since p19 appears to be a substrate for calpain, which becomes activated following genotoxic stress. Finally, the E2F1 transcription factor is shown to be involved in p19 transcriptional regulation in response to β-amyloid peptide treatment. Neuronal cells overexpressing p19 promoted DNA repair more efficiently and exhibited reduced levels of cell death in response to β-amyloid peptide or neocarzinostatin treatment, compared to control cells. The opposite effect was observed in cells with reduced p19 expression. The same genotoxic stimuli also induced the p19 gene in hippocampal neurons and, in these cells, downregulation of p19 led to impaired DNA repair and enhanced apoptosis following genotoxic stress. The presence of p19 influenced long-term neuronal sensitivity and conferred resistance to neurotoxic stress. In vivo studies showed that ablation of p19 in mouse hippocampal neurons correlates with an increased percentage of cells displaying signs of DNA damage after neocarzinostatin injection. In summary, the data described in this thesis supports the hypothesis of p19 as a neuroprotective factor, implicated not only in the mechanisms of DNA repair in response to exogenous genotoxic stress, but also affecting neuronal cell resistance and survival in response to the endogenous processes leading to neurodegeneration.

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Registro:
Título : Mecanismo de activación de P191NK4d y su papel como factor neuroprotector frente a la injuria genotóxica     =    Mechanism of activation of p191NK4d and its role as a neuroprotective factor during genotoxic stress
Autor : Ogara, María Florencia
Director : Cánepa, Eduardo Tomás
Consejero : Cánepa, Eduardo Tomás
Jurados : Vázquez, Elba Susana  ; Calcaterra, Nora Beatriz  ; Saravia, Flavia Eugenia
Año : 2012
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5043_Ogara
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Neurociencias
Química / Química Biológica
Palabras claves : P19INK4D; NEURODEGENERACION; REPARACION DEL DNA; APOPTOSIS; HIPOCAMPO; PEPTIDO ß; AMILOIDE; NEOCARZINOSTATINA; CDK5; CALPAINA; CALCIO; P19INK4D; NEURODEGENERATION; DNA REPAIR; APOPTOSIS; HIPPOCAMPUS; ß-AMYLOID PEPTIDE; NEOCARZINOSTATIN; CDK5; CALPAIN; CALCIUM
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