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Ver el documento (formato PDF)   Allievi, Mariana Claudia.  "S-layer de Bacillus sphaericus: caracterización, regulación, análisis funcional y aplicaciones"  (2012)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Las cepas de Bacillus sphaericus 2362 (cepa de referencia), C7 y C11 (nuevos aislamientos) todas pertenecientes al grupo IIA, son entomopatógenas contra larvas de mosquitos. Además de las envolturas habituales de bacterias Gram positivas, estas cepas están recubiertas de una capa externa de una estructura proteica cristalina: la capa S o Surface layer (S-layer) que estaría asociada un polímero secundario de pared (SWCP). En las 3 cepas se observa que la proteína S-layer tiene un PM de aproximadamente 125 kDa y que es reconocida por el mismo anticuerpo. Tratamientos con LiCl, que remueven la S-layer sin afectar la viabilidad, permitieron observar que en esa condición estas células (carentes de S-layer) crecen más lentamente que las células con S-layer y que en medios hipersalinos solo crecen al recuperar S-layer. El análisis por western blot con un anticuerpo anti S-layer de la cepa 2362, mostró que en las células tratadas la síntesis de S-layer se inició muy temprano durante el crecimiento bacteriano. Las modificaciones en tamaño, concentración, ubicación (fijadas a membrana, asociada a esporas, o libres en el sobrenadante) en función de las etapas de su crecimiento y de las condiciones de estrés hiperosmótico (altas concentraciones de NaCl), nos indican posibles modificaciones postraduccionales, siendo la glicosilación la más frecuentemente reportada. Los resultados de agregación de cultivos y tinción con azul de bromo-timol fueron contradictorios respecto a la presencia de glicosilación cuando se comprarn con los de tinción empleando un kit comercial que distingue proteínas glicosiladas. Se discuten distintas posibilidades: Oglicosilación no enzimática, desprendimiento de la S-layer con el SWCP. Por otro lado se exploraron dos funciones importantes que estas proteínas aportarían a la bacteria: bioabsorción de metales y actividad mosquitocida. Distintas especies de Bacillus han sido involucradas en la asociación con metales como bioadsorbentes, pero hasta el momento no hay un claro entendimiento de las propiedades quelantes. Con ese objetivo, se analizó la capacidad de bioadsorción de cobre en cultivos y esporas de bacterias Gram positivas de especies que producen o no S-layer. Sólo aquellas cepas provistas de S-layer, como Bacillus sphaericus y B. thuringiensis, mostraron una bioadsorción significativa tanto en cultivos como en esporas. Esta capacidad (cercana al 50%) se retuvo luego de un proceso de calentamiento suave de los cultivos, indicando que elementos estructurales de la envoltura son los responsables de esta propiedad. Las S-layer purificadas de dos cepas de Bacillus sphaericus mantuvieron la capacidad de bioadsorber cobre mostrando que la propiedad está directamente asociada a ellas. Se determinaron los parámetros de bioadsorción para la cepa B. sphaericus 2362 que responden al modelo de Langmuir. Tanto la afinidad como la capacidad de bioadsorción fueron comparables con otros bioadsorbentes de origen bacteriano. Se observó un efecto competitivo de Ca2+ y Zn2+, aunque no de Cd2+, lo que indicaría que esta proteína podría retener otros metales además de cobre lo que explicaría su persistencia en ambientes contaminados. La utilización del anticuerpo anti-S-layer permitió determinar que la S-layer permanece adherida a la espora y que sólo las esporas sin lavados intensivos (que eliminan la Slayer) captan eficientemente el cobre. Por primera vez se mostró una correlación directa entre el contenido de S-layer y la capacidad de bioadsorción. Esta capacidad está ligada a la retención de las S-layer adheridas a las células y esporas de Bacillus. Algunas cepas de Bacillus sphaericus son tóxicas para larvas de mosquitos, y sus propiedades insecticidas se deben principalmente a la inclusión cristal que se produce durante la esporulación. Se inspeccionó la actividad insecticida de las S-layer de las cepas 2362 y C7. Se encontró que las S-layer per se muestran actividad contra larvas de Culex. En experimentos con preparaciones de espora-cristal tóxicas en conjunto con la S-layer, se observó un efecto sinérgico aportado por esta proteína. La S-layer de la cepa C7 en particular aumenta el rango de huésped hacia mosquitos del género Aedes para los cuales B. sphaercius no es eficiente. Los análisis in silico de la estructura de la Slayer muestran un motivo con actividad hemolítica que fue confirmado por experimentos realizados in vitro. Esta actividad explicaría los resultados de toxicidad de las S-layer.

Abstract:
Bacillus sphaericus strains 2362 (reference strain), C7 and C11 (new isolated strains), all of them belonging to the homology group IIA, are entomopathogenic against mosquito larvae. In addition to the usual envelopes of Gram positive bacteria, this strains are covered by an external layer with a crystalline protein structure: the S-layer or surface layer. This layer could possibly be associated to a secondary wall polymer (SWCP). In the 3 strains the S-layer protein has a molecular weight of approximately 125 kDa recognized by the same antibody. Treatments with LiCl, that removed the S-layer without affecting their viability, allowed to observe that in this condition these cells (without S-layer) grow slower than those with S-layer. In hypersaline mediums they only grow when they restore the S-layer. The western blot analysis using the anti S-layer antibody against strain 2362, showed that treated cells recover S-layer synthesis early during the start of bacterial growth The modifications in size, concentration, location (fixed to membrane, associated with spores, or free in the supernatant) are related to the growing stages and stress conditions (high NaCl concentrations) indicating possible posttranslational modifications, being the glycosylation the most frequent. The cultures segregation and staining with bromothymol blue results are in contradiction with those obtained with commercial kit staining that distinguishes glycosylated proteins. Different possibilities are discussed as non enzymatic O-glycosylation and S-layer detachment with the SWCP. On the other hand, two important functions of this protein as metal biosorption and mosquitocidal activity have been explored. Various Bacillus species have been implicated as biosorbents of metals, but so far there is no clear understanding of the chelating properties. To that end, we examined the ability of copper biosorption in cultures and spores of Gram positive species with and without S-layer. Only those strains provided with S-layer as Bacillus sphaericus and B. thuringiensis, showed a significant biosorption both in cultures and spores. This capacity (about 50%) was retained after a mild heating of cultures, indicating that structural elements of the envelope are responsible for this property. The S-layer extracted from two strains of Bacillus sphaericus maintained the ability to bioadsorb copper showing that the property is directly associated with this protein. Biosorption parameters were determined for S-layer of strain B. sphaericus 2362 and showed to respond to the Langmuir model. Both the affinity and biosorption capacity were comparable with other bacterial biosorbents. A competitive effect of Ca2+ and Zn2+, but not of Cd2+, was also observed, indicating that other cations may be biosorbed by this protein, which would explain the persistence of this bacterium in polluted environments. The use of anti-S-layer antibody allowed to determine that the S-layer remains attached to spores and that only those not submitted to intensive washing (which eliminate the Slayer), efficiently capture copper. This was the first time that a direct correlation between the content of S-layer and the capacity of biosorption was shown. This capacity is linked to the retention of S-layer proteins attached to Bacillus spores and cells. Some Bacillus sphaericus strains are toxic to mosquito larvae, and their insecticidal properties are mainly due to crystal inclusions produced during sporulation. The insecticidal activity of the S-layer of strains 2362 and C7 was inspected. It was found that the S-layer per se showed activity against Culex larvae. In experiments with toxic spore-crystal preparations in conjunction with the S-layer, we observed a synergic effect provided by this protein. In particular, the S-layer of strain C7 increased the host range to Aedes mosquitoes for which B. sphaercius is not efficient. In silico analysis of the structure of the S-layer show a domain with possible hemolytic activity which was confirmed by in vitro experiments. This activity would explain the results of S-layer toxicity and increased host range.

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Registro:
Título : S-layer de Bacillus sphaericus: caracterización, regulación, análisis funcional y aplicaciones    
Autor : Allievi, Mariana Claudia
Director : Sánchez de Rivas, Carmen
Consejero : Pettinari, Julia
Jurados : López, Nancy Irene  ; Erijman, Leonardo  ; Semorile, Liliana
Año : 2012
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Bacterias Gram positivas, sus fagos y estrés
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5143_Allievi
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Microbiología
Biología / Bioquímica
Palabras claves : BACILLUS SPHAERICUS; S-LAYER; BIORREMEDIACION; ESTRES; ACTIVIDAD INSECTICIDA; BACILLUS SPHAERICUS; S-LAYER; BIOREMEDIATION; STRESS; INSECTICIDAL ACTIVITY
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