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Ver el documento (formato PDF)   Gambino, Yésica Paola.  "Regulación de la expresión génica de leptina por estradiol en células placentarias"  (2013-03-15)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La placenta produce un amplio número de moléculas esenciales para el establecimiento y el mantenimiento del embarazo. En este contexto, la leptina presenta un papel importante en la reproducción. La leptina es una proteína de 16 kDa codificada por el gen LEP, y fue descripta originalmente como una molécula producida por el tejido adiposo involucrada en la regulación del metabolismo a nivel central. Sin embargo, se ha sugerido que esta proteína presenta otras funciones durante la gestación, particularmente en la placenta, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. La síntesis de leptina en células trofoblásticas está modulada por diferentes agentes endógenos, pero aún no se comprende totalmente cómo se regula su expresión génica. En este trabajo, se analizó el efecto del 17β-estradiol (E2) sobre la expresión de leptina en la placenta humana utilizando dos modelos experimentales: la línea celular BeWo, derivada de coriocarcinoma, y explantos de placentas humanas a término. Se ha observado la estimulación de la expresión de leptina endógena en respuesta a E2, a través de ensayos de Western blot y qRT-PCR. Este efecto fue dosis y tiempo dependiente e involucraría a los receptores de estrógenos, ya que el antagonista ICI 182,780 inhibió la acción del E2. Además, experimentos de transfección transitoria mostraron que el tratamiento con E2 aumentó la actividad transcripcional del promotor de leptina, y la región promotora comprendida entre -1951 pb y -1847 pb sería necesaria y suficiente para observar los efectos del E2. La acción de E2 también involucraría receptores de membrana, ya que la incubación con este esteroide promovió la fosforilación de MEK, ERK 1/2 y AKT en explantos placentarios. Apoyando esta hipótesis, el análogo E-BSA, que no atraviesa la membrana plasmática, indujo la expresión de leptina en ambos modelos experimentales, y activó rápidamente las vías de señalización de las MAPKs y PI3K. Los efectos del E2 y del E-BSA fueron bloqueados por inhibidores farmacológicos de las vías MAPKs y PI3K así como también a través de la expresión de mutantes dominantes negativas de MEK, ERK 1/2 y AKT, sugiriendo que estas cascadas de señalización estarían involucradas en la regulación de la expresión de leptina. Por otro lado, se ha demostrado la presencia del receptor de estrógenos alfa (ERα) en el núcleo y en la membrana plasmática de las células BeWo. Esta proteína podría mediar los efectos genómicos y no genómicos del E2. Apoyando esta idea, la sobreexpresión de ER potenció los efectos del E2, mientras que la disminución de los niveles de ERα a través de un ARN de interferencia específico disminuyó los efectos del E2 y del E-BSA sobre la expresión de leptina. El análisis in silico del promotor de leptina mostró posibles sitios ERE y half ERE para la unión de receptores ER, además de distintas secuencias que podrían interactuar con los factores de transcripción AP-1, CREB, NFκB y Sp1. La expresión de isoformas wild type o mutantes dominantes negativas de estas proteínas mostraron una posible interacción entre ellas y los ERs, la cual podría estar implicada en la regulación de la expresión de leptina placentaria. En conclusión, este trabajo demuestra que el E2 induce la expresión de leptina en células trofoblásticas a través de acciones genómicas y no genómicas, donde participan receptores de estrógenos de membrana y nucleares, distintos factores de transcripción y diferentes vías de transducción de señales. Estos mecanismos pueden estar desregulados en distintas patologías del embarazo.

Abstract:
The placenta produces a wide number of molecules that play essential roles in the establishment and maintenance of pregnancy. In this context, leptin has emerged as an important player in reproduction. Leptin, the 16,000 MW protein product of the LEP gene, was originally described as an adipocyte-derived signaling molecule for the central control of metabolism. However, it has been suggested that leptin is involved in other functions during pregnancy, particularly in the placenta, where it was found to be expressed. The synthesis of leptin in trophoblastic cells is regulated by different endogenous biochemical agents, but the regulation of placental leptin expression is still poorly understood. In the present work, we analyzed the effect of 17β-estradiol (E2) on leptin expression in human placenta using two experimental models: BeWo choriocarcinoma cells and human placental explants. We have found a stimulatory effect of E2 on endogenous leptin expression, which was analyzed by Western blot and qRT-PCR. This effect was time and dose dependent and involved estrogen receptors, as the antagonist ICI 182 780 inhibited E2-induced leptin expression. Moreover, transient transfection experiments showed that E2 treatment enhances leptin promoter activity, and a minimal promoter region between -1951 and -1847 bp is both necessary and sufficient to achieve E2 effects. E2 action probably involves membrane receptors too, since treatment with E2 promoted MEK, ERK 1/2 and AKT phosphorylation in placental explants. Supporting this hypothesis, the membrane-constrained E2 conjugate, E-BSA, induced leptin expression in both experimental models, and rapidly activated different MAPKs and PI3K pathways. The effects of E2 and E-BSA could be blocked by pharmacologic inhibition of these signaling pathways or through the expression of dominant negative mutants of MEK, ERK 1/2 or AKT, suggesting that those signaling pathways are involved in the regulation of leptin expression. On the other hand, we demonstrated the presence of estrogen receptor alpha (ERα) in the nucleus and its association to the plasma membrane of BeWo cells. We showed that E2 genomic and nongenomic actions could be mediated by ERα Supporting this idea, the over-expression of ERα potentiated the effects of E2, while the downregulation of ERα level through a specific siRNA, decreased E2 and E-BSA effects on leptin expression. In silico analysis of a region of the leptin promoter revealed potential consensus ERE and half ERE sites for ER and also elements for different transcription factors such as AP-1, CREB, NFκB and Sp1. The expression of wild type or dominant negative mutant isoforms of these proteins demonstrated a possible interaction between them and ERs, which could be implicated in the regulation of placental leptin expression. In conclusion, we provide evidence demonstrating that E2 induces leptin expression in trophoblastic cells through genomic and nongenomic actions, involving crosstalk between membrane and nuclear estrogen receptors, transcription factors and different signal transduction pathways. These mechanisms could be dysregulated in pathological pregnancies.

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Registro:
Título : Regulación de la expresión génica de leptina por estradiol en células placentarias     =    Regulation of leptin gene expression by estradiol in placental cells
Autor : Gambino, Yésica Paola
Director : Varone, Cecilia L.
Consejero : Calvo, Juan Carlos
Jurados : Jawerbaum, Alicia Sandra  ; Galigniana, Mario Daniel  ; Panzetta de Dutari, Graciela M.
Año : 2013-03-15
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Fisiología Molecular Placentaria
Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5272_Gambino
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Genética
Biología / Bioquímica
Palabras claves : LEPTINA; 17ß-ESTRADIOL; PLACENTA; EXPRESION GENICA; RECEPTOR DE ESTROGENOS; VIAS DE TRANSDUCCION DE SEÑALES; LEPTIN; 17ß-ESTRADIOL; PLACENTA; GENE EXPRESSION; ESTROGEN RECEPTOR; SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAYS
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