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Ver el documento (formato PDF)   Portal, Patricio.  "Citocromo P450 reductasas y metabolismo redox en Trypanosoma cruzi"  (2013-03-22)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La citocromo P450 reductasa (CPR) es una flavoproteína que coordina la transferencia de electrones desde el NADPH hacia distintas hemoproteínas, como los citocromo P450 (CYPs), el citocromo b5, y la hemooxigenasa. Los CYPs se encuentran involucrados tanto en la síntesis de compuestos endógenos, tales como esteroles y ácidos grasos, como en la activación y detoxificación de compuestos exógenos. Pese a que existen numerosos genes CYP funcionales en mamíferos, existe sólo una CPR en cada especie. La producción de una clase especial de esteroles, entre los que se incluyen el ergosterol y otros metil-esteroles, es una importante vía metabólica involucrada en el crecimiento y la viabilidad celular de microorganismos eucarióticos, como protozoos u hongos, que se encuentra ausente en mamíferos. En T. cruzi se han identificado y caracterizado bioquímicamente una familia de genes integrada por tres putativas CPRs, llamadas TcCPR-A, TcCPR-B y TcCPR-C, cuyas secuencias poseen los dominios conservados para FMN, FAD y NADPH. TcCPR-A carece del domino hidrofóbico amino terminal. La sobreexpresión de TcCPR-B en epimastigotes incrementa su resistencia a drogas, sugiriendo su participación en el metabolismo de detoxificación del parásito. En la búsqueda de un rol fisiológico para las TcCPRs, en el presente trabajo se analizó el efecto de la sobreexpresión de las mismas, centrándose principalmente en su posible participación en la biosíntesis de esteroles. Una cepa de Saccharomyces cerevisiae deficiente para CPR fue utilizada en ensayos de complementación con las TcCPRs recombinantes de T. cruzi. La baja tasa de crecimiento y la disminución de la resistencia al ketoconazole de la levadura mutante, lograron revertirse parcialmente sólo con TcCPR-B y -C. La sobreexpresión de TcCPR-A en células de epimastigotes resulta letal, produciendo un aumento del contenido de ADN, una morfología aberrante y numerosas alteraciones ultraestructurales. La sobreexpresión de TcCPRB y -C incrementó la biosíntesis de ergosterol y la relación NADP+/NADPH. Los parásitos transgénicos con mayor contenido de ergosterol presentaron un aumento en el orden de membrana, con la respectiva disminución de la endocitosis. Notablemente, TcCPR-B se ha encontrado en reservosomas mientras que TcCPR-C se ha localizado en el retículo endoplasmático. Los resultados obtenidos en esta Tesis junto al correspondiente análisis bibliográfico permiten proponer un rol para las TcCPRs en mecanismos de estrés (TcCPR-A), en reacciones de detoxificación (TcCPR-B) y en la biosíntesis de esteroles (TcCPR-C).

Abstract:
Cytochrome P450 reductase (CPR) is a flavoprotein that coordinates transfer of electrons from NADPH to various hemoproteins such as cytochrome P450 (CYPs), cytochrome b5, and heme oxygenase. CYPs are involved both in the synthesis of endogenous compounds, such as sterols and fatty acids, as in the activation and detoxification of exogenous compounds. Although there are numerous functional CYP genes in mammals, there is only one CPR in each species. Sterol production is an important metabolic pathway involved in cell growth and viability. Eukaryotic microorganisms such as protozoa and fungi produce a special class of sterols absent in mammals, including ergosterol and other methyl-sterols. It has been identified and biochemically characterized three putative CPRs in Trypanosoma cruzi, called TcCPR-A, TcCPR-B and TcCPR-C. These sequences have the characteristic conserved domains for FMN, FAD and NADPH. However TcCPR-A lacks the Nterminal hydrophobic domain. Overexpression of TcCPR-B epimastigotes of T. cruzi increased drug resistance, suggesting it involvement in detoxification metabolism of the parasite. In search for a physiological role of TcCPRs, function of these enzymes and the effect of overexpression were analyzed, focusing mainly on their possible involvement in sterol biosynthesis. A Saccharomyces cerevisiae mutant, CPR deficient strain, was used in complementation assays with recombinant TcCPRs. Only TcCPR-B and -C partially succeed to reverse low growth rate and decreased resistance to ketaconazole of the mutant. Overexpression of TcCPR-A is lethal in epimastigote cells, producing an increase in DNA content, aberrant morphology and numerous ultrastructural alterations. TcCPR-B and -C overexpression increased ergosterol biosynthesis and NADP+/NADPH ratio. Moreover, transgenic parasites present more ergosterol and higher membrane order, with a corresponding decrease in endocytosis. Notably, TcCPR-B was found in reservosomas, while TcCPR-C was located in the endoplasmic reticulum. Results obtained in this Thesis suggest a role for TcCPRs in stress mechanisms (TcCPR-A), in detoxification reactions (TcCPR-B) and in biosynthesis of sterols (TcCPR-C).

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Registro:
Título : Citocromo P450 reductasas y metabolismo redox en Trypanosoma cruzi     =    Cytochrome P450 reductases and redox metabolism in Trypanosoma cruzi
Autor : Portal, Patricio
Director : Paveto, María Cristina
Consejero : Calvo, Juan Carlos
Jurados : García, Gabriela Andrea  ; Pignataro, Pedro Omar  ; Machado, Estela E.
Año : 2013-03-22
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular, "Dr. Héctor N. Torres" (INGEBI)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5299_Portal
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Bioquímica
Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : TRYPANOSOMA CRUZI; CITOCROMO P450; CITOCROMO P450 REDUCTASA; METABOLISMO; DETOXIFICACION; SINTESIS DE ERGOSTEROL; TRYPANOSOMA CRUZI; CYTOCHROME P450; CYTOCHROME P450 REDUCTASE; METABOLISM; DETOXIFICATION; ERGOSTEROL SYNTHESIS
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