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Ver el documento (formato PDF)   Gómez, Maximiliano.  "Desarrollo de caña de azúcar transgénica resistente al Sugarcane mosaic virus (SCMV) y al Sorghum mosaic virus (SrMV) por silenciamiento génico"  (2012)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El desarrollo de plantas transgénicas que explotan el mecanismo de silenciamiento génico contra los virus causales del mosaico (SCMV y SrMV) representa una interesante estrategia alternativa a los métodos de mejoramiento genético clásico. Sin embargo hasta el momento dichas estrategias han sido implementadas en base al conocimiento de unas pocas secuencias virales, lo que incrementa la posibilidad de que la resistencia sea quebrada por variantes poco frecuentes del virus. Se desarrolló un protocolo simple, rápido y económico diseñado para obtener secuencias virales a partir de un gran número de hojas de caña sintomáticas. Utilizando dicho protocolo se analizó la estructura poblacional de los virus causales del mosaico de la caña de azúcar en la Argentina y las áreas cañeras limítrofes de Bolivia, Uruguay y Paraguay, incluyendo 103 sitios de muestreo. Se analizaron 567 muestras sintomáticas por RT-PCR (pertenecientes a 104 genotipos de caña de azúcar) amplificando un fragmento del gen de la proteína de cápside del SCMV y del SrMV con iniciadores reportados en la literatura. Los productos de amplificación fueron secuenciados directamente. El análisis de las secuencias virales determinó que el principal agente causal de mosaico en la región es el SCMV, presente en 94% de las muestras. El SrMV estaba presente en solo 2,8% de las muestras, con bajos porcentajes de coinfección de los dos virus (0,5%). Las secuencias fueron analizadas filogenéticamente y clasificadas en cuatro grupos virales utilizando un valor de corte de 0,91 de identidad de secuencia, con un nuevo grupo viral (W) propuesto dentro de la clasificación del SCMV reportada en la literatura. Se diseñó un transgén de resistencia para desencadenar el silenciamiento génico contra todas las variantes virales encontradas en el muestreo realizado. Se seleccionaron tres fragmentos del genoma viral evolutivamente conservados: parte del gen P3 (función probables de anclaje a membrana del complejo de replicación) y dos fragmentos no homólogos del gen de la proteína de cápside, para ser clonados en direcciones opuestas a ambos lados de un intrón (construcción tipo horquilla), bajo la dirección del promotor del gen de la ubiquitina de maíz. Se obtuvieron plantas transgénicas de cinco variedades de caña de azúcar de interés comercial y fueron desafiadas con el SCMV en un ensayo de inoculación artificial en invernáculo y en un ensayo a campo bajo condiciones naturales de infección en la Chacra Experimental (provincia de Salta). Resultados preliminares indican la ocurrencia de eventos resistentes a la infección con mosaico de cuatro variedades de caña. El análisis molecular de un grupo de eventos es consistente con una resistencia mediada por silenciamiento génico. Se planea la realización de ensayos a campo para confirmar el fenotipo de resistencia a mosaico e identificar eventos que conserven las características agronómicas del genotipo transformado.

Abstract:
Attractive alternatives to traditional resistance breeding in sugarcane against sugarcane and sorghum mosaic virus (SCMV and SrMV, respectively), both causal agents of mosaic disease, have derived from transgenic approaches exploiting gene silencing. Such approaches, however, have been implemented based upon relatively few available virus sequences, therefore it is possible that infrequent variants escape gene silencing and break resistance. We developed a simple, fast and economic protocol designed to obtain viral sequences from a large set of symptomatic sugarcane leaf samples. Using this protocol, we estimated the population structure of potyviruses causing sugarcane mosaic disease throughout the sugarcane growing area of Argentina and neighboring regions in Bolivia, Uruguay and Paraguay by analyzing sugarcane leaf samples showing mosaic symptoms from 103 locations, including commercial and experimental fields. A set of 567 samples from 104 sugarcane genotypes were extracted and analyzed for the presence of a genomic fragment including most of the SCMV and SrMV coat protein coding regions by RT-PCR using reported sets of primers. PCR products were directly sequenced using the same amplification primers. Sequence analysis demonstrated that SCMV is the predominant mosaic virus infecting sugarcane in the region, and is present in 94% of the samples. SrMV was present only in 2.8% of samples, with low (0.5%) coinfection rates. Sequences were subject to phylogenetic analysis and classified into four viral groups using a 0.91 nucleotide identity cutoff, and a new group (W) was proposed to be included in the SCMV classification previously reported. A resistance transgene was designed to trigger silencing mediated resistance against all virus variants found in the large scale survey. Three viral fragments: a P3 gene fragment and two nonoverlapping fragments from the coat protein gene, were cloned in opposite directions separated by an intron in a hairpin construct, and placed under the maize UBI promoter. Transgenic sugarcane plants belonging to 5 varieties were obtained and putative events were tested in the greenhouse with artificial inoculation and in a field trial at Chacra Experimental (Salta province) under natural infection conditions. Preliminary results indicate the occurrence of events from four sugarcane varieties that are resistant to mosaic infection. Preliminary molecular analysis are consistent with a resistance mechanism mediated by gene silencing. Further analysis are needed to identify resistant events that have a good agronomic performance as well.

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Registro:
Título : Desarrollo de caña de azúcar transgénica resistente al Sugarcane mosaic virus (SCMV) y al Sorghum mosaic virus (SrMV) por silenciamiento génico     =    Development of transgenic sugarcane resistant to Sugarcane mosaic virus (SCMV) and Sorghum mosaic virus (SrMV) by gene silencing
Autor : Gómez, Maximiliano
Director : del Vas, Mariana
Director Asistente : Serino, Germán
Consejero : Hopp, Esteban
Jurados : Castagnaro, Atilio  ; García, María Laura  ; Zelada, Alicia
Año : 2012
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Chacra Experimental Agrícola Santa Rosa, Salta
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5329_Gomez
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Agrobiotecnología
Biología / Genética
Biología / Ingeniería Genética
Palabras claves : DIVERSIDAD GENETICA DEL MOSAICO; MUESTREO VIRAL A GRAN ESCALA; TRANSFORMACION DE PLANTAS; PTGS; ENSAYO EN INVERNACULO Y A CAMPO; LARGE SCALE VIRAL SAMPLING; MOSAIC GENETIC DIVERSITY; COAT PROTEIN; PLANT TRANSFORMATION; PTGS; GREENHOUSE AND FIELD PERFORMANCE
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