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Ver el documento (formato PDF)   Fauerbach, Jonathan Arturo.  "Caracterización de las etapas tempranas de la agregación de alfa-sinucleína in vitro mediante sondas fluorescentes ESIPT y microscopia de fuerza atómica"  (2013)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La Enfermedad de Parkinson (EP) es el desorden neurodegenerativo motor más frecuente, caracterizado por la presencia de agregados proteicos amiloideos intra y extraneuronales conocidos como Cuerpos de Lewy (CL). El principal componente de estas estructuras es alfa-sinucleína (AS), una proteína presináptica de 140 aminoácidos abundante en células dopaminérgicas del cerebro aunque su función fisiológica permanece aún desconocida. En su forma libre nativa AS carece de una estructura secundaria definida pudiendo adoptar múltiples conformaciones en solución y en asociación con otras proteínas y membranas. Se cree que los CL y las fibras amiloides maduras (mafs) son el resultado de un proceso de mal plegamiento, auto-ensamblado y asociación de AS y que posiblemente sirven como mecanismos de protección para la célula, a través de la redistribución en la población de las especies tóxicas intermediarias solubles asociadas a etapas tempranas. Estudio in vitro de las especies y procesos involucrados en la agregación de AS brindan la posibilidad de entender los mecanismos subyacentes en EP. El diseño de nuevas formas de detección de las especies intervinientes en el proceso de agregación y el estudio de los mecanismos de formación de dichos intermediarios tempranos poseen una alta importancia. En esta tesis, se sintetizaron sondas fluorescentes sensibles a cambios en la polaridad de su microentorno que permiten monitorear el proceso de auto-ensamblado y asociación de AS marcada covalentemente con estos compuestos. Dichas sondas demuestran una muy alta sensibilidad al proceso en estudio, proveyendo una novedosa metodología de monitoreo en continuo con la mínima perturbación del sistema. Diversas sondas fueron sintetizadas basándose en la familia de las 3-hidroxicromonas (3HC), compuestos altamente sensibles a los cambios de polaridad de su entorno. Su particular estructura química posibilita el fenómeno conocido como ESIPT (‘Excited State Intramolecular Proton Transfer o Transferencia Protónica Intramolecular en el Estado Excitado’). En ESIPT se produce una transferencia protónica intramolecular en el estado excitado obteniendo dos formas excitadas cada una con un nivel de energía distinto. Con lo cual estos compuestos fluorescentes ESIPT presentan dos bandas de emisión en lugar de una sola. La posición, intensidad y relación entre las bandas de emisión se modifican de acuerdo a los cambios en la polaridad, formación de enlaces por puentes de hidrógeno, y acidez/basicidad del microentorno de la sonda. Las nuevas sondas 3HC sintetizadas resultaron reporteros muy versátiles para el proceso de agregación de AS, particularmente sensibles a las etapas tempranas a cuyos agregados de AS se les adjudica la mayor citotoxicidad. La combinación de distintas sondas de polaridad han permitido obtener datos experimentales acerca de la formación y desaparición de intermediarios pre-amiloideos transientes. Las curvas de agregación obtenidas y sus cambios espectroscópicos fueron complementadas con un análisis por Microscopia de Fuerza Atómica (AFM). Mediante un estudio sistemático por AFM se lograron identificar las diferentes especies provenientes del proceso de autoensamblado de AS, donde cada una de las especies fue caracterizada y catalogada. Estudios a diferentes temperaturas permitieron evaluar su influencia en la cinética y termodinámica del proceso de agregación. Incubaciones a baja temperatura (4°C) permitieron definir un mínimo local de energía en la coordenada de la agregación, revelando una novedosa especie supramolecular (la "acuna") que muestra indicios de estar directamente involucrada en el paso clave de la formación de estructuras fibrilares. Estudios preliminares sobre células SH-SY5Y en cultivo dan indicios de que las acunas son citotóxicas. A través de la Crio-Microscopía de Transmisión Electrónica (Cryo-ET) se obtuvo información estructural con resolución sub-nm de esta novedosa especie supramolecular. Los estudios dieron lugar a la formulación de un nuevo esquema secuencial de agregación (SAS) para AS, basándose en conceptos de química coloidal, de polímeros y supramolecular. SAS distingue 3 etapas de la agregación: molecular, coloidal y fibrilar, en función de las estructuras halladas, su orden secuencial lineal y orquestado de interconversión, su presencia transiente (aparición y desaparición) y morfología característica. Además, SAS distingue etapas exergónicas y endotérmicas del proceso global, señalando un mínimo local de energía correspondiente con la formación de la acuna. Se prevé que este modelo pudiera ser útil no sólo para AS sino para otras proteínas amiloideas “intrínsicamente desordenadas” asociadas a enfermedades neurodegenerativas similares, abriendo la posibilidad de la existencia de un mecanismo común y unificado. Esta tesis doctoral involucra un estudio desde lo sintético orgánico y la biofísica estructural, utilizando microscopias de alta resolución y herramientas fluorescentes avocadas al estudio y la descripción del proceso integro de agregación de AS, obteniendo nuevos datos relevantes al área que son interesantes de continuar y ser explorados por el aporte que puedan rendir en el contexto biomédico.

Abstract:
Parkinson's disease (PD) is the most common neurodegenerative motor disorder, characterized by the presence of intra and extraneuronal amyloid protein aggregates known as Lewy bodies (LB). The main component of these structures is alpha-synuclein (AS), a presynaptic protein of 140 aminoacids abundant in dopaminergic brain cells, although its function is not fully understood. In its native form AS has no defined secondary structure and can adopt multiple conformations in solution and in association with other proteins and membranes. It is believed that LB and mature amyloid fibers (mafs) are the result of a process of AS misfolding, self-assembly and association (where the trigger remains unknown), which are believed to play a neuroprotective role through the redistribution of the population of intermediate toxic soluble species associated with early stages. In vitro studies of the process provide the means for controlling the conditions under which aggregation occurs and offer the possibility to study their dynamics so as to understand the underlying mechanisms. The design of new means for detecting the involved species in AS aggregation has high priority in order to elucidate the mechanisms of formation of these early intermediates and certain their potential role in the context of PD. This thesis describes the synthesis of fluorescent probes sensitive to changes in the polarity of their microenvironment’s which have served to monitor the process of self-assembly and association of AS. Such probes show a high sensitive for the early stages of the process under study, providing a novel continuous monitoring methodology with minimal perturbation of the system. Different probes based on the family of 3-hydroxychromones (3HC) were synthesized, being organic compounds highly sensitive to changes in the polarity of their environment. Their unique chemical structure leads to the phenomenon known as ESIPT (‘Excited State Intramolecular Proton Transfer’), a process by which an intramolecular proton is transfered in the excited state leading two the formation of two states with different energy levels. As a consequence, these compounds exhibit two emission bands instead of one. The position, intensity and ratio of the bands are modified according to changes in the polarity, hydrogen-bonding potential, and acidity/basicity of the microenvironment of the probe. The new probes are versatile reporters of AS aggregation, particularly sensitive to the early stages and species to which the highest cytotoxicity is attributed. The combination of different polarity probes have provided experimental data on the formation and disappearance of pre-amyloid transient intermediates. Spectroscopic data for the progress curves of aggregation were complemented by analysis by Atomic Force Microscopy (AFM). Through a systematic study by AFM it was possible to identify the different species in the self-assembly process of AS, where each species was characterized and cataloged. Studies at different temperatures allowed the evaluation of their influence on the kinetics and thermodynamics of the aggregation. Incubations at low temperature (4°C) helped to define a local energy minimum of the aggregation coordinate, revealing a novel supramolecular species (the "acuna") with evidence that it is directly involved in key steps leading to the formation of fibrillar structures. Preliminary studies on SH-SY5Y cells provided evidence that these species are cytotoxic. Through cryotransmission electron microscopy (Cryo-ET) structural information was obtained with subnm resolution of the so-called "latent" acunas. These studies have led to the formulation of a new sequential aggregation scheme (SAS) for AS, based on concepts of colloidal, polymers and supramolecular chemistry. SAS distinguishes 3 stages of aggregation: molecular, colloidal and fibrillar according to the found structures, their sequential orchestrated interconversion, their transient presence (or absence) and their particular morphology. In addition, SAS distinguishes exergonic and endothermic stages of the overall process, pointing to a specific local energy minimum. It is anticipated that this model could be useful not only for AS and PD but for other "intrinsically disordered" amyloid proteins associated with neurodegenerative diseases, opening the possibility that a common and unified mechanism may exist. This thesis features a study encompassing synthetic organic chemistry and structural biophysics, using high-resolution microscopy and fluorescent tools to study and describe the entire process of the in vitro aggregation of AS, obtaining new relevant data to the field and with implications in the biomedical context, which required and justify further exploration.

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Registro:
Título : Caracterización de las etapas tempranas de la agregación de alfa-sinucleína in vitro mediante sondas fluorescentes ESIPT y microscopia de fuerza atómica     =    Characterization by fluorescent ESIPT probes and atomic force microscopy of early stages in the in vitro aggregation of alfa-synuclein
Autor : Fauerbach, Jonathan Arturo
Director : Jares-Erijman, Elizabeth A.
Jovin, Thomas M.
Director Asistente : Giordano, Luciana
Consejero : Jares-Erijman, Elizabeth A.
Jurados : Erra-Balsells, Rosa  ; Delfino, José María  ; Tricerri, María Alejandra
Año : 2013
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Centro de Investigación en Hidratos de Carbono (CIHIDECAR)
Departamento de Química Orgánica
Centro Multidisciplinario I
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Orgánica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5357_Fauerbach
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Orgánica
Química / Química Biológica
Biología / Biomedicina
Palabras claves : ALFA-SINUCLEINA; ENFERMEDAD DE PARKINSON; SONDAS FLUORESCENTES; ESIPT; AFM; CRIO-ET; OLIGOMEROS; INTERMEDIARIOS; AGREGACION; ALPHA-SYNUCLEIN; PARKINSON´S DISEASE; FLUORESCENT PROBES; ESIPT; AFM; CRYO-ET; OLIGOMERS; INTERMEDIARIES; AGGREGATION
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