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Ver el documento (formato PDF)   Salinas, Silvina R..  "Caracterización bioquímica y estructural de glicosiltransferasas bacterianas"  (2013-06-19)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Los polisacáridos juegan un papel esencial en el metabolismo celular y en el funcionamiento de los organismos. Son sintetizados empleando enzimas glicosiltransferasas (GTs), cuyas propiedades determinan el tamaño y la estructura del producto final. Muchas GTs están localizadas en membranas celulares, dificultando su purificación y caracterización. En este trabajo de Tesis se estudian bioquímica y biofísicamente dos GTs que participan en la síntesis del polisacárido xantano producido por Xanthomonas campestris. La primer GT es GumI, de la cual sólo había escasos antecedentes genéticos. En esta Tesis se presenta la primera caracterización bioquímica y funcional de GumI, demostrando su actividad glicosiltransferasa previamente propuesta. Se realizaron ensayos de complementación funcional, demostrando su actividad manosiltransferasa in vivo. Además, se demostró que GumI está unida a la membrana, y que la interacción está mediada por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. GumI fue purificada y su actividad fue estudiada in vitro, obteniéndose los parámetros óptimos de reacción. GumI dio origen a una nueva familia, GT-94, en la clasificación Carbohydrate Active EnZymes. Finalmente, mediante ensayos de cristalización se obtuvieron agujas bidimensionales que al presente no fueron aptas para resolver la estructura de GumI por cristalografía de rayos-X. La segunda GT es GumK, cuya estructura cristalina se resolvió en el laboratorio y, como GumI, es una GT monotópica de membrana. Se profundizó sobre las bases moleculares de la unión a sus sustratos y a la membrana. Se realizaron diferentes mutaciones sobre la zona propuesta de unión a la membrana, demostrando la complejidad de dicha interacción. Además, se realizaron estudios por simulación computacional con el fin de obtener la estructura del complejo GumK/UDP-GlcA. El modelo obtenido explicaría la especificidad por este sustrato. Estudios realizados en este trabajo mediante diversas técnicas -tales como proteólisis limitada, fluorescencia, dicroísmo circular, calorimetría isotérmica de titulación, resonancia magnética nuclear y dispersión de rayos-X a bajo ángulo- sugieren fuertemente la presencia de cambios conformacionales disparados por la unión de UDP-GlcA.

Abstract:
Polysaccharides, which play a crucial role in cellular metabolism and in the performance of organisms, are synthesized by glycosyltransferase (GT) enzymes, whose properties determine the size and structure of the final product. Many GTs are localized in cellular membranes, difficulting their purification and characterization. In this Thesis, two GTs (GumI and GumK) which participate in the synthesis of the polysaccharide xanthan produced by Xanthomonas campestris were studied biochemically and biophysically. The genetic background data on GumI is limited. This Thesis reports the first functional and biochemical characterization of GumI, demonstrating its previously proposed glycosyltransferase activity. Functional complementation demonstrated its in vivo mannosyltransferase activity. Results also show that GumI is a membrane-associated protein, and that the interaction is mediated by hydrophobic and electrostatic forces. GumI was purified and its activity was studied in vitro, obtaining optimal reaction parameters. Finally, crystallization experiments allowed obtaining bidimensional needles, which were not suitable to resolve GumI structure by X-ray crystallography. GumK, whose structure was resolved in the laboratory, is a monotopic GT, like GumI. This Thesis deepened on the molecular basis of the binding to its substrate and the membrane. Mutagenesis of residues of the region proposed for membrane binding was performed, resulting in no-soluble protein and thus demonstrating the complexness of membrane interaction. Moreover, computational simulation studies were carried out with the aim to obtain a model of the GumK/UDP-GlcA structure. The model obtained may explain the GumK specificity for this substrate. Studies performed by various techniques, such as fluorescence, circular dichroism, isothermal titration calorimetry, nuclear magnetic resonance, and small-angle X-ray scattering, strongly suggest the presence of conformational changes in GumK triggered by the UDP-GlcA binding.

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Registro:
Título : Caracterización bioquímica y estructural de glicosiltransferasas bacterianas     =    Biochemical and structural characterization of bacterial glycosyltransferases
Autor : Salinas, Silvina R.
Director : Ielpi, Luis
Consejero : Ielpi, Luis
Jurados : Caramelo, Julio Javier  ; Comerci, Diego José  ; Iglesias, Alberto Alvaro
Año : 2013-06-19
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Instituto Leloir
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5385_Salinas
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biología Molecular y Celular
Biología / Bioquímica
Palabras claves : GLICOSILTRANSFERASAS; XANTANO; GUMK; GUM I; XANTHOMONAS CAMPESTRIS; CAMBIOS CONFORMACIONALES; PROTEINAS DE MEMBRANA; GLYCOSYLTRANSFERASAS; XANTHAN; GUM K; GUM I; XANTHOMONAS CAMPESTRIS; CONFORMATIONAL CHANGES; MEMBRANE PROTEINS
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