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Ver el documento (formato PDF)   Giraldez, Adrián Nicolás.  "Diseño de un sistema de genética reversa del virus de la fiebre aftosa"  (2013-11-19)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El presente trabajo tiene como objetivo generar un sistema para ser utilizado como herramienta en técnicas de genética reversa vinculadas al estudio del virus de la Fiebre Aftosa. Se diseñó y construyó un clon basado en una copia en ADN del genoma completo de la cepa O1/Campos, que se transcribe a partir del promotor de la polimerasa del fago T7. A pesar de detectar replicación del genoma viral por identificación de ARN de cadena negativa en las células transfectadas y en pasajes sucesivos de éstas, no se observó generación de efecto citopático en células BHK-21. Se valoró la influencia de algunos cambios en nucleótidos sobre esta incapacidad, tales como mutaciones en la secuencia amino acídica, estructura secundaria del ARN, estructura secundaria y terciaria de las proteínas involucradas, y se generaron reversiones de las mutaciones que se consideraron más importantes. Se desarrolló un sistema de cuantificación de ARN viral por RT-PCR en Tiempo Real. Por otro lado, se generaron dos replicones mediante el remplazo parcial o completo de las proteínas de la cápside viral por el gen reportero Luc, incapaz de generar virus infeccioso, de modo de poder realizar estudios en laboratorios de nivel bioseguridad menos estrictos. Este sistema puede usarse para el estudio funcional de las proteínas no estructurales del virus, así como de las regiones 5’ y 3’ no codificantes. Se detectó replicación por identificación de ARN de cadena negativa en las células transfectadas así como traducción de proteínas virales por medio de técnicas de inmunofluorescencia indirecta.

Abstract:
The aim of the present work was to build a reverse genetic system for the molecular study of Foot-and-mouth Disease virus (FMDV). A full-length cDNA clone based on the genomic sequence of O1/Campos strain was cloned downstream of the T7 polymerase promoter. Genomic RNA was transcribed in vitro from this clone after linearization of the plasmid cDNA. Although replication of the viral genome was confirmed through the detection of negative strand RNA in transfected cells and subsequent passages, cytopathic effect on BHK-21 cells was not observed. The influence of nucleotide changes on this phenotype, such as aminoacid changes, RNA secondary structure, protein secondary and tertiary structure, were carefully analyzed, and several reversions of mutations were carried out. A Real Time RT qPCR assay to quantify FMDV RNA was developed. In a second step of this work, two replicons derived from the full length clone were constructed by partial or complete replacement of the sequences encoding the viral capsid proteins with those of the Luc gene. These replicons have the advantage that they are unable to generate infectious virus, and therefore require less strict biosecurity conditions. This system can be used for the study of the role of FMDV nonstructural proteins and the 5’ and 3’ UTRs during viral replication. Replication of the constructs was confirmed in transfected cells through detection of negative strand RNA by RT-PCR and detection of translation of viral proteins by indirect immunofluorescence techniques.

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Registro:
Título : Diseño de un sistema de genética reversa del virus de la fiebre aftosa     =    Design of a reverse genetic system for foot-and-mouth disease virus
Autor : Giraldez, Adrián Nicolás
Director : Mattion, Nora Marta
Malirat, Viviana
Consejero : Cánepa, Eduardo Tomás
Jurados : Taboga, Oscar Alberto  ; Castilla, Viviana  ; Mbayed, Viviana Andrea
Año : 2013-11-19
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Inflamación y Cáncer
Instituto de Ciencia y Tecnología D. César Milstein (ICT Milstein)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5447_Giraldez
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Virología
Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA; GENETICA REVERSA; CLON INFECCIOSO; REPLICON; INGENIERIA GENETICA; FOOT AND MOUTH DISEASE VIRUS; REVERSE GENETICS; INFECTIOUS CLONE; REPLICON; GENETIC ENGINEERING
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