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Ver el documento (formato PDF)   Pretel, Miguel Esteban.  "La proteína no-estructural NS1 exclusiva del virus respiratorio sincicial: mecanismo de plegamiento y ensamblado quasi-espontáneo de oligómeros esféricos estables"  (2014)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Los Paramixovirus son una familia diversa de virus ARN de cadena negativa pertenecientes al orden de los Mononegavirales. Estos virus han evolucionado diversas estrategias para bloquear los mecanismos de respuesta inmune innata del huésped en el curso de un proceso infeccioso. El virus respiratorio sincicial (RSV) es la mayor causa de enfermedad pediátrica en el mundo. Este virus, contiene a dos proteínas no estructurales (NS1/NS2) la cuáles sólo se encuentran en RSV y no muestran homología con ninguna otra proteína. NS1 y NS2 han sido postuladas como los principales factores de virulencia de RSV, interviniendo en el bloqueo de la respuesta inmune inducida por el virus. Se han identificado múltiple blancos celulares que interactúan con NS1 y NS2, principalmente relacionados a las vías de inducción y respuesta a interferón. En este trabajo de tesis, se realizó el estudio de la conformación de NS1 en solución, haciendo uso de métodos bioquímicos y biofísicos para su estudio. Como primera medida, se desarrolló un protocolo de expresión y purificación que permitió obtener un rendimiento de 10 mg/L de proteína homogénea en solución. Se determinó que NS1 es un monómero plegado globular, el cual contiene regiones flexibles que presentan intercambio conformacional. La temperatura induce cambios estructurales que llevan a la formación de oligómeros esféricos solubles (NS1SOs) los cuales presentan propiedades amiloides. Se analizó la cinética de formación de estos oligómeros, a partir de lo cual se propone un modelo de ensamblado identificando eventos clave para el proceso. Por otro lado, estudios de plegamiento al equilibrio indican que NS1 se despliega cooperativamente en un proceso reversible de dos estados (Nativo – Desplegado), mientras que NS1SOs primero se disocia a monómeros nativos y luego se despliega. Estudios de cinética de plegado de NS1, indican que mientras que el desplegado de la proteína es relativamente sencillo, su plegado es complejo y limitado cinéticamente por la presencia de múltiples intermediarios, compatible con heterogeneidad cis/trans de prolinas en el estado desplegado. En resumen, en el presente trabajo se describe la diversidad conformacional de la proteína NS1. Esta proteína se encuentra en cuasi-equilibrio con oligómeros esféricos y estables, los cuales se forman en condiciones compatibles con un entorno celular. Estos estudios constituyen los primeros en analizar los equilibrios conformacionales para esta proteína y podrían explicar sus múltiples blancos y funciones reportadas.

Abstract:
Paramixoviruses are a diverse family of negative-strand RNA viruses that belong to the order of Mononegavirales. These viruses evolved different strategies in order to block the host innate immunity during infection. Respiratory Syncytial Virus (RSV) is the major infectious agent that causes pediatric respiratory disease worldwide. RSV contains the two non structural proteins (NS1 and NS2) which are unique to RSV and show no homology to any other protein in relation to its primary structure. These two proteins were postulated as the RSV major virulence factors, and play a central role in blocking the immune response induced by the virus. Multiple cellular targets have been reported for NS1 and NS2, mainly related to the interferon pathways. In this thesis, we studied the NS1 conformation in solution, making use of different biochemical and biophysical techniques. First, we developed an expression and purification protocol which allowed us to obtain 10 mg/L of highly purified protein. We observed that NS1 is a folded and globular monomer which contains some flexible regions subject to slow conformational motions. Temperature induces a cooperative structural change leading to soluble and spherical oligomers (NS1SOs) with amyloid properties. We performed a kinetic analysis which allowed us to propose a model in relation to oligomer formation, identifying key events of the process. Equilibrium folding studies revealed that NS1 unfolds following a two-state reaction, in a fully reversible process, whereas NS1SOs first dissociates into native monomers and them unfolds. On the other hand, kinetic folding studies indicated that although unfolding is a rather simple process, refolding is complex, limited by multiple kinetic intermediates, compatible with prolyl cis/trans heterogeneity in the unfolded state. In summary, the present work describes the conformational diversity of the NS1 protein. NS1 exists in quasi-equilibrium with stable and spherical oligomers, which are formed in conditions compatible with a cellular environment. This work represents the first study in relation to conformational equilibria of the NS1 protein and may explain its multiple binding partners and functions reported.

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Registro:
Título : La proteína no-estructural NS1 exclusiva del virus respiratorio sincicial: mecanismo de plegamiento y ensamblado quasi-espontáneo de oligómeros esféricos estables     =    The non structural protein NS1 exclusive from RSV: folding mechanism and quasi-spontaneous assemble of stable spherical oligomers
Autor : Pretel, Miguel Esteban
Director : de Prat Gay, Gonzalo
Consejero : Zorreguieta, Angeles
Jurados : Caramelo, Julio Javier  ; Delfino, José María  ; Ermacora, Mario Roberto
Año : 2014
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires (IIBBA). Laboratorio de Estructura-Función e Ingeniería de Proteínas
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5494_Pretel
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Virología
Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL; NS1; PLEGAMIENTO; OLIGOMEROS ESFERICOS; AMILOIDES; RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS; NS1; FOLDING; SPHERICAL OLIGOMERS; AMYLOIDS
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