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Ver el documento (formato PDF)   Chamorro, María Eugenia.  "Modificación de la funcionalidad de la eritropoyetina por carbamilación. Mecanismos de acción sobre células eritroides y neuronales"  (2014-03-25)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La eritropoyetina (Epo) es conocida como la hormona que regula la producción de células eritroides. Sin embargo, su rol biológico se expandió a partir del hallazgo de la expresión de receptores específicos en otros tejidos, incluyendo el nervioso. Además, se describió un efecto neuroprotector de la hormona, el cual estaría asociado a inhibición de apoptosis. Debido al interés por expandir el uso farmacológico de la Epo hacia la protección de tejidos no hematopoyéticos, se intensificó la búsqueda de estructuras modificadas de la proteína. La entidad que merece, actualmente, mayor investigación es la Epo carbamilada en los residuos lisina (cEpo). Evidencia derivada de estudios in vitro y en animales de experimentación indican que esta forma de Epo mantiene su actividad neuroprotectora mientras que carece de actividad eritropoyética. Esta diferente función evitaría un aumento innecesario de la masa eritroide en el tratamiento de pacientes no anémicos con enfermedades neurodegenerativas. Con el objeto de profundizar el conocimiento sobre las diferencias observadas en la función de Epo debido a la carbamilación, en el presente trabajo se utilizó un modelo que involucra células fisiológicas y varias líneas celulares para evaluar, en conjunto y comparativamente, los efectos de cEpo y de Epo en ensayos paralelos. Fueron utilizados cultivos de células progenitoras eritroides de médula ósea de ratón, distintas líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide, tales como UT-7, dependiente de Epo para su supervivencia, TF-1, dependiente de GM-CSF y puede proliferar en presencia de Epo por períodos cortos y K562, independiente de factores de crecimiento específicos, así como la línea de origen neuronal SH-SY5Y. El primer paso consistió en realizar la carbamilación de Epo recombinante, utilizando cianato de potasio, empleando distintos tiempos y concentraciones de cianato apropiadas para asegurar un completo bloqueo de los residuos lisina de la Epo. El éxito de la carbamilación fue verificado mediante electroforesis en gel y Western blotting, demostrándose el aumento de la carga neta negativa de cEpo con respecto a la de Epo. La modificación de la estructura de la proteína por carbamilación puede causar alteraciones funcionales, cuyo estudio constituye el objetivo de este trabajo de tesis. Los cultivos de células UT-7 y TF-1 en presencia de cEpo mostraron una significativa disminución de la viabilidad celular, provocando la muerte celular por apoptosis, mientras que la Epo mantuvo la viabilidad e indujo la proliferación celular de ambas líneas celulares. La cEpo tampoco pudo estimular el desarrollo de unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E) en cultivos de células de médula ósea de ratón, ni previno la apoptosis inducida por la citoquina proinflamatoria TNF-α en células eritroileucémicas K562. En cambio, cEpo, al igual que Epo, actuó como factor antiapoptótico frente a la inducción de muerte celular programada inducida por TNF-α o staurosporina en células neuronales SH-SY5Y. Los resultados de ensayos de inhibición de vías de señalización intracelular permiten sugerir que las acciones neuroprotectoras de Epo y cEpo son mediadas por la activación de Jak2/PI3K. Estos resultados confirmaron que las modificaciones moleculares introducidas en la molécula de Epo por el proceso de carbamilación generan la pérdida de su habilidad para mantener la supervivencia de las células con capacidad de diferenciación eritroide pero no afecta su acción neuroprotectora mostrando, en este caso, una actividad similar a la de la Epo nativa. Mediante ensayos competitivos y de inhibición por anticuerpos, tanto en las células SH-SY5y como en las TF-1, se observó que la Epo puede actuar a través del receptor homodimérico (REpo/REpo) y el heterodimérico formado por una subunidad REpo y una subunidad ß common (Rßc), que es también subunidad del receptor de GM-CSF. En cambio, cEpo necesita de las subunidades REpo y Rßc para prevenir la apoptosis de las células neuronales. A partir de la hipótesis de que la carbamilación de Epo le permite conservar su capacidad neuroprotectora pero le impide inducir la proliferación de células eritroides, el siguiente objetivo fue la investigación de vías de señalización que juegan un papel clave en la proliferación celular inducida por Epo. Si bien en cultivos de células eritroides UT-7 y TF-1 cEpo indujo la fosforilación de Jak2, primer paso de activación celular, demostramos por primera vez la incapacidad de cEpo para mantener la fosforilaión de Akt y FOXO3a por el mismo periodo que lo hace Epo. Esto lleva a la translocación de FOXO3a al núcleo promoviendo la expresión de la proteína regulatoria del ciclo celular p27Kip1 y generando, así, el arresto del ciclo celular por cEpo. Dado que el efecto diferencial de cEpo y Epo con respecto a la proliferación celular se encontraría asociado al silenciamiento de vías de señalización por aumento de la velocidad de defosforilación analizamos la expresión y actividad de una fosfatasa, la tirosina fosfatasa 1B (PTP1B), involucrada en la desregulación de la señalización por Epo. Comprobamos que la inducción de PTP1B es significativamente mayor en presencia de cEpo, incremento que parece estar asociado al aumento de calcio intracelular inducido por este factor. La colocalización de PTP1B con el Rßc sustenta la conclusión de que la fosfatasa desfosforila la señalización de cEpo, interrumpiendo la vía de supervivencia y, en consecuencia, la proliferación celular, explicando, al menos en parte, la acción diferencial entre Epo y cEpo sobre células eritroides. Palabras claves: eritropoyetina carbamilada, eritropoyetina, proliferación celular, receptor de eritropoyetina, receptor ß common, tirosina fosfatasa 1B, eritropoyesis, neuroprotección.

Abstract:
Erythropoietin (Epo) is known as the hormone regulating the production of erythroid cells. However, its biological role was expanded after the discovery of specific receptors expressed in other tissues, including the nervous tissue. Moreover, a neuroprotective effect that could be associated to apoptosis inhibition was described for the hormone. Due to the interest in expanding the pharmacological use of Epo over the protection of non-hematopoietic tissues, the search for modified structures of the protein became more intense. The chemical entity currently under investigation is the Epo carbamylated in lysine residues (cEpo). Results from in vitro and in vivo experiments indicate that this form of Epo retains its neuroprotective ability, while lacking in erythropoietic activity. This different function would prevent an unnecessary increase in erythroid mass in non-anemic patients under treatment for neurodegenerative diseases. With an aim to further the existing knowledge of the changes observed in Epo after carbamylation, in the present work we used a model involving physiological cells as well as cell lines, to globally and comparatively evaluate the effects of Epo and cEpo in parallel assays. Erythoid progenitor cells from mouse bone marrow were used to study the development of colony-forming units-erythroid (CFU-E). The cell lines capable of erythroid differentiation employed were UT-7, dependent on Epo for survival, TF-1, dependent on GM-CSF and able to proliferate in the presence of Epo for short periods, and K562, independent of any specific growth factor where cell line of neuronal origin was SH-SY5Y. The first step in the work consisted in the carbamylation of rhuEpo using potassium cyanide. This salt decomposes when dissolved generating an anion which allows it to bind the protein’s lysine residues. The carbamylation process was carried out at different times and cyanide concentrations to ensure complete binding, and therefore the blockage of Epo’s lysine residues. The carbamylation of Epo was confirmed by gel electrophoresis, electrotransfer and immunodetection, where cEpo showed a decrease in positive charge due to the blockage of lysines, and consequently an increase in its net negative charge in comparison to Epo. In the carbamylation product (cEpo), a carbamyl group is coupled to each lysine residue in the Epo molecule, thus modifying the protein structure and potentially causing functional alterations. In the presence of cEpo, cultures of UT-7 and TF-1 cells showed a significant decrease in cell viability, leading to cell death by apoptosis, whereas Epo maintained viability and induced proliferation of both cell lines. cEpo did not support the development of colony-forming units-erythroid (CFU-E) in cultures of mouse bone marrow cells, nor did it prevent apoptosis induced by the proinflammatory cytokine TNF-α in erythroleucemic K562 cells differentiated with hemin. On the other hand, both cEpo and Epo acted as antiapoptotic agents protecting from the induction of programmed cell death by TNF-α or staurosporin in neuronal SH-SY5Y cells. Based on inhibition assays for intracellular signaling pathways, it may be suggested that the antiapoptotic action of cEpo and Epo is mediated by the activation of Jak2/PI3K. Our results confirmed that the modifications introduced in the Epo molecule after carbamylation produce a loss of its ability to support the survival of cells capable of erythroid differentiation, but it does not affect its neuroprotective action on SH-SY5Y cells, showing an activity similar to that of the native Epo. By carring out inhibition and competence assays, we found that Epo can act through both receptors involved in neuronal SH-SY5Y and TF-1 cells: the homodimer (REpo/REpo) and the heterodimer comprising a REpo monomer and a ßcommon subunit (Rßc), which is also present in the GM-CSF receptor. We observed that cEpo requires both REpo and the R c subunit to prevent apoptosis in neuronal cells. Owing to the fact that after carbamylation Epo maintains its antiapoptotic ability but can no longer induce erythroid cell proliferation, the following objective of this work was to investigate the signaling pathways playing a key role in Epoinduced cell proliferation. Although in cultures of erythroid UT-7 and TF-1 cells cEpo induced Jak2 phosphorylation, which is the first step of cell activation, we demonstrated for the first time that cEpo was unable to maintain Akt and FOXO3a phosphorylated for the same period of time as did Epo. Dephosphorylation of FOXO3a, which promotes its translocation to the nucleus as the transcription factor for the cell cycle regulatory protein p27kip1, was demonstrated through an increase in the expression of the latter in cultures with cEpo. Since the differential effect of Epo and cEpo on cell proliferation may be associated to the silencing of transduction pathways by an increase in the dephosphorylation rate, we analyzed the expression and activity of the tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), involved in the the desregulation of Epo’s signalling. We found that PTP1B induction is significantly higher with cEpo, an increase which seems to be linked with the rise in intracellular calcium induced by this factor. Co-localization of PTP1B and Rßc supports the conclusion that the enzyme dephosphorylates Epo’s signalling faster than that of cEpo, thus interrupting pathways of survival, and consequently, of proliferation. This explains, at least in part, the differential effects of Epo and cEpo on erythroid cells. Keywords: erythropoietin, carbamylated erythropoietin, cell proliferation, erythropoietin receptor, ß common receptor, tyrosine phosphatase 1B, erythropoiesis, neuroprotection.

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Registro:
Título : Modificación de la funcionalidad de la eritropoyetina por carbamilación. Mecanismos de acción sobre células eritroides y neuronales     =    Functional modification of erythropoietin due to carbamylation. Mechanisms of action on erythroid and neuronal cells
Autor : Chamorro, María Eugenia
Director : Nesse, Alcira B.
Director Asistente : Vittori, Daniela C.
Consejero : Varone, Cecilia
Jurados : Quintana, Irene Luisa  ; Roque, María Elena  ; Heller, Paula Graciela
Año : 2014-03-25
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica / Laboratorio de Fisiología Celular de la Eritropoyetina
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5510_Chamorro
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Biológica
Palabras claves : ERITROPOYETINA CARBAMILADA; ERITROPOYETINA; PROLIFERACION CELULAR; RECEPTOR DE ERITROPOYETINA; RECEPTOR ß COMMON; TIROSINA FOSFATASA 1B; ERITROPOYESIS; NEUROPROTECCION; ERYTHROPOIETIN; CARBAMYLATED ERYTHROPOIETIN; CELL PROLIFERATION; ERYTHROPOIETIN RECEPTOR; ß COMMON RECEPTOR; TYROSINE PHOSPHATASE 1B; ERYTHROPOIESIS; NEUROPROTECTION
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