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Ver el documento (formato PDF)   Legisa, Danilo Mario.  "Estudio de aislamientos nacionales y desarrollo de una vacuna a subunidad, direccionada a células presentadoras de antígenos, para el Virus de la Lengua Azul"  (2014-04-03)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La Lengua Azul es una enfermedad que afecta principalmente rumiantes salvajes y doméstico, y representa una importante barrera para el comercio internacional de animales y sus subproductos. El Virus de la Lengua Azul es el causante etiológico de la enfermedad y es transmitido por insectos hematófagos del género Culicoides. El Virus de la Lengua Azul , es el miembro prototipo del género Orbivirus dentro de la familia Reoviridae. El virión está compuesto por una doble capa proteica desnuda que envuelve un genoma de 10 segmentos lineales de ARNdc, los cuales codifican para al menos diez proteínas, 7 proteínas estructurales y al menos 4 no estructurales. La distribución del Virus de la Lengua Azul es global aunque en ciertas zonas la información es escasa. En Sudamérica, evidencia serológica de la presencia del virus fue encontrada todos los países menos Uruguay y Bolivia. Argentina y Brasil son los únicos países donde ha sido aislado el virus. En Argentina han sido obtenidos 5 aislamientos de Virus de la Lengua Azul serotipo4 en ganado bovino. Tres de estos aislamientos fueron logrados entre los años 1999-2001, mientras los dos restantes fueron obtenidos en los años 2009 y 2010 como parte del presente trabajo de tesis. La medida de control más práctica y eficaz es la inmunización profiláctica de los animales susceptibles. Desde principios del siglo XX se han desarrollado vacunas atenuadas e inactivadas eficientes para la Lengua Azul. Sin embargo, las desventajas en cuanto a bioseguridad y efectos adversos impulsan el desarrollo de vacunas a subunidad, no infecciosas como alternativa a las vacunas convencionales. En este trabajo de tesis se abordó un análisis epidemiológico molecular de los aislamientos argentinos del VLA y el desarrollo de una vacuna a subunidad direccionada a células presentadoras de antígeno. El análisis epidemiológico molecular se basó en la obtención y análisis de las secuencias de 5 de los 10 segmentos virales (Segmentos 2, 3, 6, 7 y 10). El análisis de los segmentos 2 y 6 resultó en un cluster de secuencias argentinas dentro del clado del serotipo 4 y también dentro del grupo del nucleotipo A (definido para cada segmento). El análisis de los segmentos 3, 7 y 10 mostró que los aislamientos argentinos agrupan dentro del cluster de aislamientos de topotipo occidental o western, indicando que su origen se remontaría a África/Europa. El análisis filogenético reveló que, además de este origen, las secuencias argentinas representaron un fuerte linaje Sudamericano de evolución independiente. El desarrollo de la vacuna a subunidad se basó en la expresión de la proteína VP2, mayoritaria de la cápside externa e inmunodominante, sola o fusionada a la molécula APCH (Antigen Presenting Cell Homing) capaz de dirigir moléculas a células presentadoras de antígeno, utilizando el sistema de expresión de baculovirus. Los ensayos de inmunogenicidad en cobayos y bovinos utilizando estos dos antígenos, resultaron en altos títulos de anticuerpos neutralizantes similares a los evocados por la vacuna formulada con virus inactivado. Más aún, se obtuvieron títulos comparables para VP2 y dosis 4 veces menores de APCH-VP2 demostrando la capacidad APCH de potenciar la generación de anticuerpos. Como caracterización de la respuesta inmune asociada se analizó el perfil de inmunoglobulinas G y la presencia de células T de memoria. El perfil de IgG en los bovinos inmunizados con APCH-VP2 mostró una mayor proporción de IgG1 en comparación con los grupos vacunados con VP2 sola o con el virus inactivado. Por otro lado, la inmunización con las vacunas experimentales, mostró generación de células T de memoria para VP2 sola. Además, se comprobó la capacidad de las vacunas recombinantes de diferencias animales vacunados de infectados. Esta sección constituye un aporte en el desarrollo de vacunas a subunidad, capaces de generar una respuesta inmune comparable a vacunas inactivadas pero con características emergentes.

Abstract:
Bluetongue disease affects principally wild and domestic ruminants and represents a major barrier to animal trade and their sub products. The etiological agent is the Bluetongue Virus, it is transmitted by hematophagous arthropods from the genus Culicoides. Bluetongue Virus is the prototype member of genus Orbivirus and it belongs to Reoviridae family. The non enveloped virión is composed by two concentric protein layer which contents the viral genome, composed by ten dsRNA segments. This genome codifies for 7 structural proteins and at least, 4 non structural proteins. Bluetongue Virus is worldwide distributed, although there is a lack of information in certain regions. In Southamerica, serologic evidences of Bluetongue Virus were recorded in all countries except Uruguay and Bolivia. Argentina and Brazil are the only two countries where the virus was isolated. In Argentina, five Bluetongue Virus serotype 4 isolates have been obtained from asymptomatic cattle. Three isolates were obtained in years 1999-2001, and two in years 2009 and 2010 as result of this thesis work. Prophylactic immunization of susceptible animals is the most practical and effective measure to prevent Bluetongue disease. From beginning of XX century, attenuated and inactivated vaccines against Bluetongue Virus have been developed, however, biosafety issues and the well known adverse effects lead to the development of subunit vaccines as an alternative to classic ones. In this work, we performed a molecular epidemiology study of Argentinean Bluetongue Virus isolates and we also developed a subunit vaccine delivered to antigen presenting cells. The molecular epidemiology approach was based on the sequence analysis from 5 out of 10 genome segments (Segments 2, 3, 6, 7, and 10). Segments 2 and 6 analysis showed that Argentinean sequences grouped into the serotype 4 cluster and nucleotype A group, and even more, they grouped in a unique Argentinean cluster whit high bootstrap value. Segments 3, 7 and 10 analysis, showed that Argentinean isolates grouped into a western topotype cluster, along with sequences already classified as originated in Africa and/or Europe. Phylogenetic analysis revealed that all Argentinean sequences formed a well supported Southamerican lineage with independent evolutionary history. The subunit vaccine development was based on the baculoviral expression of VP2 protein, the major and immunodominant component of the outer capsid, alone or fussed to a molecule named APCH (antigen presenting cell homing), capable to deliver peptides or molecules to antigen presenting cells. Immunogenicity assays conducted in guinea pigs and cattle showed that both antigens were able to induce high neutralizing antibodies titers similar to those evoked by the inactivated vaccine. Moreover, VP2 antibody titers were comparable to APCH-VP2 titers which were generated using a 4 times lower dose of antigen, demonstrating the ability of APCH molecule to enhance the generation of antibodies. As part of the immune response characterization, immunoglobulin G profile and the presence of memory T cells were analyzed. IgG profile in animals vaccinated whit APCH-VP2 showed a higher proportion of IgG1 in comparison with VP2 and inactivated BTV groups. On the other hand, immunization with both candidate vaccines showed the generation of memory T cells specific to VP2. In addition, the capacity of the recombinant vaccine to differentiate vaccinated animal from infected ones was confirmed. This section represents a contribution in the development of Bluetongue Virus subunit vaccines capable of generating an immune response comparable to inactivated vaccines but with new and advance features.

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Registro:
Título : Estudio de aislamientos nacionales y desarrollo de una vacuna a subunidad, direccionada a células presentadoras de antígenos, para el Virus de la Lengua Azul     =    Study of national isolates and development of subunit vaccine delivered to antigen presenting cells for Bluetongue Virus
Autor : Legisa, Danilo Mario
Director : Dus Santos, María José
Consejero : Damonte, Elsa
Jurados : Taboga, Oscar Alberto  ; Candurra, Nélida Alicia  ; Flichman, Diego Martín
Año : 2014-04-03
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVyA). Instituto de Virología. Laboratorio de Vacunas de Nueva Generación
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5526_Legisa
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Virología
Biología / Farmacología
Biología / Inmunología
Palabras claves : VIRUS DE LA LENGUA AZUL; EPIDEMIOLOGIA; ARGENTINA; VACUNAS RECOMBINANTES; BLUETONGUE VIRUS; EPIDEMIOLOGY; RECOMBINANT VACCINES
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