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Ver el documento (formato PDF)   Baccarini, Leticia Cecilia.  "Interacción de la proteína quinasa dependiente de cAMP con sus genes blanco en Saccharomyces cerevisiae"  (2014-03-20)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La regulación de la expresión génica mediada por proteínas quinasas es esencial para la correcta adaptación celular frente a un estímulo extracelular. En S. cerevisiae, la PKA está formada por tres subunidades catalíticas: Tpk1, Tpk2 y Tpk3 y una subunidad regulatoria: Bcy1. Existen antecedentes que indican la asociación de Tpk1 y Tpk2 a la cromatina durante el crecimiento en glucosa, glicerol y estrés oxidativo (Pokholok et al, 2006). El rol de la vía cAMP/PKA sobre la expresión génica en glucosa ha sido ampliamente estudiado (Livas et al, 2011). Por otro lado, se ha descripto, que la activación de la PKA limita la expresión de genes de respuesta a estrés (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). Durante el desarrollo de esta tesis analizamos la unión de Bcy1, Tpk1 y Tpk2 a diferentes regiones génicas en respuesta a estrés osmótico y oxidativo. Describimos que tanto las subunidades catalíticas como la subunidad regulatoria de la PKA se encuentran asociadas tanto a regiones transcriptas como a promotores de los genes blancos de manera estrés-dependiente. Además analizamos el requerimiento de la actividad quinasa y el papel de Bcy1 en la asociación de las Tpks a la cromatina. Versiones inactivas de Tpk1 y Tpk2 no se asociaron a la cromatina. La deleción de Bcy1 promueve una mayor asociación de Tpk1, mientras que anuló la asociación de Tpk2. Luego analizamos el posible rol de las Tpk en el remodelado de la cromatina en respuesta a estrés a través del análisis de la cinética de unión de factores remodeladores de la cromatina a las regiones donde encontramos asociadas a Tpk1 y Tpk2. Observamos unión transitoria a la cromatina de Arp8, Rsc1 y Snf2 seguido temporalmente por la asociación de las Tpk. Observamos también, la ocupación concomitante de Tpk2 y el factor de transcripción de unión al DNA Rap1. En conjunto los datos existentes y los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la PKA podría participar en la expresión génica mediante fosforilación in situ de los reguladores transcripcionales o de la cromatina. La distribución núcleo-citoplasmática permite regular la actividad diferencial de muchas proteínas quinasas. Hemos analizado la localización subcelular de las subunidades de PKA y su mecanismo de transporte durante estrés. Hemos observado que Tpk1-GFP y Tpk3-GFP acumulan en el núcleo post-estrés oxidativo y osmótico, sin embargo Tpk2- GFP y Bcy1-GFP no cambian su acumulación nuclear. El análisis cinético de la acumulación nuclear de Tpk1 mostró mayor velocidad en respuesta a estrés osmótico versus oxidativo. Hemos determinado que la acumulación nuclear de Tpk1, Tpk2, Tpk3 y Bcy1 es un mecanismo de transporte activo. Sorprendentemente, cada una de las subunidades de PKA es importada al núcleo por diferentes carioferinas. Por otra parte, las cepas defectivas en carioferinas las cuales impiden la acumulación nuclear específicamente de Tpk1 o Tpk2 no mostraron asociación a la cromatina las Tpks, lo que sugiere el requerimiento de acumulación nuclear de las subunidades catalíticas para la asociación a sus genes blancos.

Abstract:
Regulation of gene expression by intracellular stimulus-activated protein kinases is essential for cell adaptation to environmental changes. There are three PKA catalytic subunits in S. cerevisiae: Tpk1, Tpk2 and Tpk3 and one regulatory subunit: Bcy1. Previous data indicates that Tpk1 and Tpk2 were found associated to the chromatin during growth on glucose, glycerol and oxidative stress (Pokholok et al, 2006). Using ChIP-real time assay we analyzed the Bcy1, Tpk1 and Tpk2 association to 5 genes regions in response to osmotic and oxidative stresses. We had demonstrated that both catalytic and regulatory subunits of PKA were associated to transcribed regions and promoters of target genes in a stress dependent manner. Furthermore we analyze the requirement of kinase activity and the role of Bcy1 protein on Tpk chromatin association. Inactive versions of Tpk1 and Tpk2 do not associate to chromatin. Deletion of BCY1 promotes higher Tpk1 association, whereas it abolished Tpk2 association. We then analyze the possible role of Tpk on chromatin remodeling in response to stress conditions. We analyze the kinetics of binding chromatin remodelers in the regions bound by Tpk1 and Tpk2 in response to stress. During stress stimulus there is a transient binding to chromatin of Arp8, Rsc1 and Snf2 - chromatin remodelers followed temporarily by Tpk association. We also observe cooccupancy of Tpk2 and DNA-binding transcription factor Rap1. The role of cAMP / PKA on gene expression in glucose has been extensively studied (Livas et al, 2011). However PKA activation limits the expression of stress responsive genes (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). These results suggest that PKA could participate in gene expression by in situ phosphorylation of transcriptional or chromatin regulators. Actually it is known that a single protein kinase distributed dynamically between cytoplasm and nucleus, can regulate target genes expression by both nuclear and cytoplasmic signaling mechanisms. Thus, the nucleus-cytoplasmic kinases transport would be important to regulate differential activity in both compartments. Here we analyze stress subcellular localization of PKA subunits and their transport mechanism, using fluorescence microscopy. We observed that Tpk1 and Tpk3 accumulate in the nucleus post-oxidative and osmotic stress however Tpk2 and Bcy1 not change their nucleus-cytoplasmic distribution, staying preferentially nuclear. Our results over Tpk1 stress re-localization kinetics suggest that under osmotic stress is necessary its faster nuclear accumulation. We determined that Tpk1, Tpk2, Tpk3 and Bcy1 nuclear accumulation is ATP dependent suggesting an active transport mechanism. Surprisingly, we found that each PKA subunits is transported into the nucleus by different karyopherins. Moreover, karyopherin mutant strains which prevent nuclear accumulation of Tpk1 or Tpk2 prevented its association with chromatin, suggesting that nuclear accumulation of catalytic subunits to association to their targets genes is required.

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Registro:
Título : Interacción de la proteína quinasa dependiente de cAMP con sus genes blanco en Saccharomyces cerevisiae     =    Interaction of cAMP-dependent Protein Kinase with its target genes in Saccharomyces cerevisiae
Autor : Baccarini, Leticia Cecilia
Director : Portela, Paula
Consejero : Moreno, Silvia
Jurados : Correa García, Susana R.  ; Shayo, Carina Claudia  ; Ceccarelli, Eduardo Augusto
Año : 2014-03-20
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Biología Molecular y Transducción de Señales
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5535_Baccarini
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Bioquímica
Biología / Epigenética
Biología / Biología Molecular y Celular
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