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Ver el documento (formato PDF)   Aprile García, Fernando.  "Estudio de las vías de señalización e inflamatorias del canal P2X7 y su variante polimórfica Gln460Arg en células del sistema nervioso central"  (2014-04-11)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Los receptores P2X7 son canales de calcio activados por ATP conformados por subunidades de dos pasos de membrana que se asocian como homotrímeros. Sus efectos son mediados por activación de la vía de las MAPK que incluye a BRaf y ERK 1/2. En el sistema nervioso central, regulan la liberación de neurotransmisores y citoquinas, y la activación glial frente a situaciones inflamatorias. Mediante distintos estudios genéticos se encontró que pacientes con trastornos depresivos poseen, con una incidencia significativa, una variante polimórfica del gen P2X7, que consiste en un cambio de un único nucleótido que produce la sustitución de Glutamina por Arginina en la posición 460 (Gln460Arg). El objetivo principal de esta tesis consiste en investigar la relación funcional entre esta variante polimórfica del receptor y la aparición de trastornos psiquiátricos. En particular, se estudiaron las cascadas de señalización activadas por el receptor P2X7, poniendo énfasis en el ingreso de calcio extracelular tras dicha activación, el rol de la cascada de las MAPK y los efectos funcionales y transcripcionales que derivan de dicha activación. Primeramente, se observó que en homocigosis la variante mutada de P2X7 tiene la misma funcionalidad que el receptor wild-type (WT). En cambio, cuando ambas subunidades fueron coexpresadas se produjo una marcada disminución en la entrada de calcio y en la activación de la MAPK ERK 1/2. Se demostró además que ambas subunidades interactúan físicamente en la membrana celular de células coexpresoras, asociándose para formar trímeros funcionales de P2X7 compuestos por subunidades WT y Gln460Arg. A su vez, nuestro grupo colaborador en el Max-Planck en Munich, Alemania, demostró que solamente los ratones knock-in que expresan ambas variantes del receptor P2X7 humano, y no aquellos que expresan una única variante, muestran alteraciones del comportamiento similares a aquellas que presentan pacientes con depresión. A continuación, se buscaron proteínas involucradas en la transducción de señales de P2X7 de interés en el marco de mecanismos inflamatorios o con un posible rol en depresión. Se detectó asociada a BRaf a la proteína Poli ADP-ribosa polimerasa 1 (PARP1), enzima clave en la respuesta celular a procesos inflamatorios. Se demostró que P2X7 activa a PARP1, aumentando los niveles totales de poli ADP-ribosilación. Estos resultados identifican a PARP1 como un modulador clave de la transducción de señales de P2X7, y describen por primera vez a P2X7 como activador de PARP1. Además se realizó un microarray de expresión génica con el fin de caracterizar las consecuencias de la coexpresión de ambas variantes a nivel transcripcional. Con estos datos se realizó un análisis bioinformático global de los perfiles de expresión génica, con el cual se hallaron alteradas distintas vías de señalización relacionadas con inflamación y depresión. También identificamos genes candidatos con expresión alterada que resultan de máximo interés en el mismo contexto: CHUK (o IKKα, quinasa del inhibidor de NFκB α) y RCAN1 (regulador de calcineurina 1). Esta expresión diferencial detectada en el microarray fue posteriormente confirmada en distintos modelos, validando y profundizando dichos hallazgos. En conclusión, mediante la caracterización de las vías de transducción de señales asociadas a la activación de las distintas variantes de P2X7, el análisis de su impacto transcripcional y su asociación con nuevas moléculas se describen por primera vez los mecanismos moleculares y celulares que podrían proveer una explicación a la asociación entre la presencia de la variante mutada de P2X7 y la aparición de trastornos psiquiátricos como la depresión.

Abstract:
P2X7 receptors are ATP-gated calcium channels conformed by subunits with two transmembrane domains that assemble as homotrimers. Its effects are mediated by activation of the MAPK pathway that involves BRaf and ERK 1/2. In the central nervous system, they regulate neurotransmitter and cytokine release, as well as glial activation after inflammatory injury. Different genetic approaches have demonstrated that a significant amount of psychiatric patients suffering from major depression possess a polymorphic variant of the P2X7 gene, consisting in a single nucleotide change leading to a Glutamine for Arginine subtitution at the position 460 (Gln460Arg). The main aim of this thesis is to investigate the functional interplay between this polymorphic variant and the onset of psychiatric symptoms. More specifically, signaling pathways elicited by P2X7 receptor were studied, with special emphasis in calcium uptake, MAPK role and the functional and transcriptional effects derived from their activation. First of all, we report that the P2X7 polymorphic variant show the same functionality than its wild-type (WT) counterpart when expressed in homocygosis. In contrast, calcium uptake and MAPK ERK 1/2 activation were severely diminished when both subunits were coexpressed. We also show that both subunits physically interact in coexpressing cells, therefore assembling P2X7 receptors that bear WT and Gln460Arg subunits. At the same time, our partner research group at the Max-Planck Institute in Munich, Germany, showed that only knock-in mice for both variants of the human P2X7 receptor show behavior alterations reminiscent of those observed in psychiatric patients, while homozygous knock-in mice do not. Afterwards, we looked for novel proteins involved in P2X7 signaling pathways that would be of interest in the context of inflammation and depression. We detected Poly ADPribose polymerase (PARP1), a key enzime for cellular response to inflammatory processes. P2X7 activates PARP1, enhancing cellular levels of ADP-ribose. These results identify PARP1 as a key modulator of P2X7 signaling mechanisms, and describe P2X7 as a novel activator of PARP1. Also, we performed an expression microarray with the aim of depicting the transcriptional consequences of coexpressing both variants. This data was used to carry out a global bioinformatic analysis of gene expression profile. We found that different signaling pathways related to inflammation and depression were altered. We also found candidate genes with altered gene expression that are of interest in this context: CHUK and RCAN1. Their differential expression detected on the microarray was confirmed employing different models, therefore validating and gaining insight into these findings. Summing up, by means of characterizing the signaling pathways associated to the activation of the different P2X7 variants, the analysis of their transcriptional impact and the association with novel molecules we describe for the first time the molecular and cellular mechanisms that could provide an explanation for the association between the P2X7 polymorphic variant and the appearance of psychiatric illnesses such as depression.

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Registro:
Título : Estudio de las vías de señalización e inflamatorias del canal P2X7 y su variante polimórfica Gln460Arg en células del sistema nervioso central     =    Study of signaling and inflammatory pathways of the P2X7 channel and its polymorphic variant Gln460Arg in central nervous system cells
Autor : Aprile García, Fernando
Director : Arzt, Eduardo
Director Asistente : Liberman, Ana C.
Consejero : Arzt, Eduardo
Jurados : Pitossi, Fernando  ; Pasquini, Juan M.  ; Wikinski, Silvia
Año : 2014-04-11
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires (IBIOBA) - Instituto Partner de la Sociedad Max Planck (MPSP)
Departamento de Fisiología Biología Molecular y Celular (FBMC). Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular (LFBM)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5590_AprileGarcia
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Neurociencias
Biología / Biomedicina
Palabras claves : P2X7; CALCIO; ERK1/2; PARP1; MICROARRAY; DEPRESION; P2X7; CALCIUM; ERK1/2; PARP1; MICROARRAY; DEPRESSION
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