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Ver el documento (formato PDF)   Jacobs, Melisa.  "Análisis estructural y bioquímico de la proteína de membrana externa GumB de Xanthomonas campestris, y su participación en la síntesis del exopolisacárido xantano"  (2014-02-26)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Muchas bacterias producen polisacáridos extracelulares que pueden asociarse a la superficie celular o ser secretados al medio extracelular. Numerosos polisacáridos bacterianos se encuentran asociados al desarrollo de patogenicidad, convirtiéndose en un importante factor de virulencia. Por otro lado, existe un gran interés industrial sobre muchos polisacáridos bacterianos debido a sus amplias aplicaciones. En general, se ha descripto en detalle los primeros pasos de la síntesis de polisacáridos, pero aún no se han esclarecido los mecanismos involucrados en la polimerización y transporte de los mismos hacia la superficie bacteriana o al medio extracelular. Se ha postulado que estos procesos serían llevados a cabo gracias a la formación de complejos proteicos que podrían atravesar la membrana plasmática, de forma similar a lo observado para los sistemas de secreción de proteínas. En esta tesis se presenta el estudio estructural y bioquímico de la proteína de membrana externa GumB, la cual se encontraría asociada a la síntesis/secreción del polisacárido xantano en Xanthomonas campestris. Fue posible sobreexpresar y purificar cantidades suficientes para ensayos estructurales de esta proteína de membrana, al expresarla en el citoplasma. Se obtuvieron cristales de la proteína nativa y de su derivado de selenio-metionina, a partir de los cuales fue posible resolver la estructura a 2,54 Å. Se encontró que en el cristal GumB forma un tetrámero, esta característica también se ha observado en solución mediante ensayos de dispersión de luz estática y entrecruzamiento químico. Por otro lado, ensayos de dispersión de neutrones a bajos ángulos mostraron que la forma de GumB en solución es similar a la observada en el cristal. El tetrámero de GumB mostró una gran cavidad con cargas positivas que podrían estar involucradas en la interacción con el xantano, el cual posee cargas negativas debido a sus residuos de ácido glucurónico y grupos cetalpiruvato. Asimismo, se presenta evidencia que sugiere la participación de GumB en un complejo proteico. Mediante ensayos de entrecruzamiento químico in vivo se observó que GumB forma complejos de alto peso molecular. Electroforesis azul nativa permitió identificar potenciales interacciones entre GumB y otras proteínas de X. campestris.

Abstract:
Many bacteria produce extracellular polysaccharides, which can be associated with the cell surface or secreted to the extracellular medium. Several bacterial polysaccharides are associated with pathogenesis development, making them an important virulence factor. On the other hand, there is an important industrial interest in many bacterial polysaccharides because of their broad applications. The steps involved in polysaccharide synthesis are well described, but less is known about polysaccharide transport to the extracellular medium. It is believed that secretion is achieved due to a protein transenvelope complex, similar to those observed for protein secretion systems. In this thesis, the outer membrane protein GumB was studied structurally and biochemically. It has been previously shown that GumB is involved in the synthesis/secretion of xanthan gum in Xanthomonas campestris. Protein overexpression and purification, in quantities enough to set up structural assays, were achieved when this protein was expressed in the cytoplasm. Crystals of native protein and its selenium-methionine derivative were obtained, allowing the determination of GumB crystal structure to 2.54 Å. In the crystal, GumB is a tetramer, a feature also observed in solution by static light scattering and chemical crosslinking assays. Besides, small angle neutron scattering assays showed that GumB envelope in solution was similar to that observed in the crystal. GumB tetramer exhibited a cavity with positive charges that could be involved in the interaction with xanthan, which is a negatively charged polysaccharide due to its glucuronic acid residues and ketalpyruvate groups. In addition, evidence suggesting that GumB is part of a protein complex is presented. By in vivo chemical crosslinking, it was observed that GumB forms high molecular complexes. Blue native electrophoresis allowed the identification of potential interactions between GumB and other proteins from X. campestris.

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Registro:
Título : Análisis estructural y bioquímico de la proteína de membrana externa GumB de Xanthomonas campestris, y su participación en la síntesis del exopolisacárido xantano     =    Structural and biochemical analysis of the outer membrane protein GumB of Xanthomonas campestris, and its involvement in xanthan gum synthesis
Autor : Jacobs, Melisa
Director : Ielpi, Luis
Consejero : Ielpi, Luis
Jurados : Wolosiuk, Ricardo  ; Delfino, José María  ; Ceccarelli, Eduardo
Año : 2014-02-26
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Instituto Leloir
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5591_Jacobs
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Biológica
Palabras claves : XANTHOMONAS CAMPESTRIS; TRANSPORTE; GUMB; XANTANO; COMPLEJOS DE MEMBRANA; XANTHOMONAS CAMPESTRIS; TRANSPORT; GUMB; XANTHAN; MEMBRANE COMPLEXES
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