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Ver el documento (formato PDF)   Fernández Bell Fano, Pablo.  "Infección persistente del virus Junín in vitro: perturbación del equilibrio virus-célula como estrategia de estudio del mecanismo involucrado en este tipo de infecciones"  (2014-10-31)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, pertenece a la familia Arenaviridae. Los virus pertenecientes a esta familia son capaces de causar infecciones persistentes en roedores, los cuales actúan como reservorios naturales, asegurándose así su evolución y perpetuación en la naturaleza. Asimismo, son capaces de multiplicar en una amplia variedad de cultivos celulares pudiendo desarrollar el estadio de persistencia en la mayoría de ellos. El objetivo de este trabajo fue determinar las diferencias existentes entre infecciones agudas y persistentes en cultivos de células Vero frente a tratamientos que tienden a desestabilizar el equilibrio virus célula. A tal fin, mediante la infección experimental de células Vero con la cepa XJCl3, se obtuvo una línea celular persistentemente infectada con dicho virus, denominada V3, que se utilizó como modelo de estudio. En los ensayos realizados con el agente mutagénico 5-fluoruracilo (5-FU) se observó que la susceptibilidad a la inhibición ejercida por esta droga sobre JUNV dependió del lapso transcurrido entre el momento de la infección y el tratamiento, y de la m.o.i. utilizada sugiriendo que la proporción de células infectadas al momento de tratar definía la resistencia a la droga. En este sentido, las células V3 resultaron menos afectadas por el 5-FU en comparación con las células infectadas y tratadas durante la etapa aguda. Por otro lado, el análisis del ciclo celular de células Vero mostró que la infección con JUNV generó alteraciones en la respuesta del cultivo frente a estímulos como la confluencia de las células de la monocapa y el tratamiento con agentes inductores de arresto del ciclo. Durante ensayos de transfección con proteínas virales dicha alteración del ciclo fue asociada a la nucleoproteína viral N. Sin embargo, a pesar de la aparente manipulación del ciclo celular por parte del virus no se pudo asociar alteraciones inducidas del ciclo, a una disminución en el rendimiento viral. Teniendo en cuenta que los cultivos persistentemente infectados no presentan el efecto citopático (EC) típico de las infecciones agudas de este virus en células Vero, se evaluó en primer lugar la naturaleza de dicho fenómeno. El estudio de distintos indicadores de apoptosis mostró que dicho evento seguía una cinética similar a la desarrollada por el EC viral, observándose además un incremento en la expresión de p53 y en el clivaje de la caspasa 3. Cuando estos indicadores se analizaron en células V3, los valores encontrados presentaron valores similares a los de células Vero sin infectar. Por otro lado, al analizar la respuesta de los distintos cultivos frente a la inducción de apoptosis con staurosporina (STS) o luz ultravioleta (UV) los cultivos persistentemente infectados resultaron más resistentes que los cultivos infectados de forma aguda y las células sin infectar frente a la apoptosis inducida por luz UV y todos se comportaron de manera similar frente a la STS. Este comportamiento sugiere que JUNV podría estar modulando negativamente la apoptosis durante la persistencia de manera específica frente a ciertos estímulos aunque no frente a un inductor fuerte como la STS. La resistencia al estrés térmico también fue evaluada como un parámetro diferencial entre los distintos tipos de cultivos. En forma similar a lo que sucedió con el 5-FU el virus resultó más resistente al tratamiento con calor cuando éste se aplicó a tiempos de tratamiento p.i. tardíos y a mayores m.o.i.. La síntesis de HSP-70, principal efector de la respuesta celular al shock térmico, no se asoció temporalmente con la reducción de los títulos virales. De manera similar a lo observado con la respuesta al shock térmico, el tratamiento con arsenito de sodio (Ars), inductor de estrés oxidativo, resultó menos efectivo cuanto mayor era la proporción de células infectadas en los cultivos. El conjunto de resultados permite concluir que las características diferenciales presentadas por los cultivos infectados en forma persistente serían adquiridas durante el transcurso de la infección, al menos en el caso de la resistencia a los inductores de: extinción viral (5-FU), estrés térmico y oxidativo (HS y Ars) y alteraciones del ciclo. Esta estrategia estaría basada en la acumulación de suficiente cantidad de proteínas, en particular, la nucleoproteína N, a fin de controlar las respuestas a estrés, ya sea por intervención directa de dichas proteínas o a través de la modulación en la formación de gránulos de estrés citoplasmáticos y/o de cuerpos nucleares asociados a la proteína de leucemia promielocítica.

Abstract:
Junín virus (JUNV), the etiological agent of the Argentine Hemorrhagic Fever, belongs to the family Arenaviridae. Viruses belonging to this family are able to cause persistent infections in rodents, which act as natural reservoirs, thus ensuring their evolution and perpetuation in nature. They are also able to multiply in a wide variety of cell cultures having the capacity to develop persistence stage in most of them. The aim of this study was to determine the differences in the response of acute and persistent infection of JUNV in Vero cells to treatments that tend to disrupt the virus-cell equilibrium typical of the latter. To this end, we obtained a cell line persistently infected with the virus, called V3, through experimental infection of Vero cells with JUNV XJCl3 strain, which was used as a study model. Studies performed with the mutagenic agent 5-fluorouracil (5-FU) showed that susceptibility to inhibition exerted by this drug on JUNV depended on the time elapsed between the time of infection and treatment, and the m.o.i. used suggesting that the proportion of infected cells when treatment was applied defined the degree of drug resistance. In this sense, the V3 cells were less affected by the 5-FU compared with treated acutely infected cells. On the other hand, cell cycle profile of Vero cells infected with JUNV was different from acutely and non infected cultures when subjected to conditions of cell cycle arrest. During transfection assays with plasmids expressing viral proteins, alterations of cell cycle, similar to those observed by infection, were associated with the expression of the viral nucleocapsid N. However, despite the apparent alteration of cell cycle by the virus, no effect on viral replication could be associated with experimentally induced cell cycle alterations. Given that persistently infected cultures do not exhibit the typical cytopathic effect (CE) characteristic of acutely infected Vero cells, the nature of this phenomenon was evaluated in first place. The study of various indicators of apoptosis showed that this event followed similar kinetics as the CE that took place in infected cells, with a concomitant increase in expression of p53 and cleavage of caspase-3. By contrast, the level of these apoptotic markers was similar for V3 and non-infected Vero cells. On the other hand, the response to two apoptosis inducers, staurosporine (STS) and UV radiation revealed that persistently infected cultures showed resistance to the latter whereas acutely, persistently and non-infected cells were equally susceptible to STS. This is probably due to the fact that induction of apoptosis by UV treatment is carried out by a specific cellular pathway that might be modulated by the virus during persistence, while STS exerts its effect as a multitarget agent. The tests performed to determine the effect of HSP-70 induction on JUNV replication of the virus showed that this protein was not involved in the reduction of viral titer. Similar to the results obtained with 5-FU, the virus was more resistant at late p.i. treatment times and high m.o.i.. Both heat-shock and treatment with the oxidative stress-inducing drug sodium arsenite (Ars) were effective in reducing viral titers. Further analysis of the activity of heat shock showed that its range of action embraced 2 steps of the viral cycle: the processes leading to the budding of virions and protein translation. Heat-shock response was also evaluated as a differential parameter among the different types of infected and non-infected cell cultures. Similarly to the conclusions withdrawn with 5-FU, JUNV infections were more resistant to heat-shock when treatment was applied late during infection or when high m.o.i. were employed. Synthesis of HSP-70, main effector of heat-shock response, could not be associated to the decrease in virus titer observed in heat-shocked cultures. Also, arsenite, an oxidative stress inducer, diminished viral replication. The degree of arsenite inhibition was dependent of the proportion of infected cells in the monolayer. Altogether, the results allow to conclude that the differential characteristics between JUNV acutely and persistently infected Vero cells would be acquired during the course of infection, at least for the resistance to 5-FU, heat shock, oxidative stress and altered cell cycle. This strategy would be based on the premise of accumulation of viral proteins, particularly the nucleoprotein, in order to control cellular response to stress, either directly or by modulating stress granules formation and/or nuclear bodies associated to the promielocytic leukemia protein.

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Registro:
Título : Infección persistente del virus Junín in vitro: perturbación del equilibrio virus-célula como estrategia de estudio del mecanismo involucrado en este tipo de infecciones     =    In vitro Junín virus persistent infections: perturbation of the equilibrium between virus and cell as a strategy of study of the mechanisms involved in this type of infections
Autor : Fernández Bell Fano, Pablo
Director : Scolaro, Luis Alberto
Consejero : Damonte, Elsa
Jurados : Martínez Peralta, Liliana A.  ; Mbayed, Viviana A.  ; Taboga, Oscar A.
Año : 2014-10-31
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica (DQB)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5613_FernandezBellFano
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Virología
Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : VIRUS JUNIN; PERSISTENCIA; MUTAGENESIS; CICLO CELULAR; APOPTOSIS; SHOCK TERMICO; JUNIN VIRUS; PERSISTENCE; MUTAGENESIS; CELL CYCLE; APOPTOSIS; HEAT SHOCK
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