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Ver el documento (formato PDF)   Crisp, Renée Leonor.  "Esferocitosis hereditaria: avance en la metodología diagnóstica, estudios demográficos e investigación de mecanismos involucrados"  (2014-12-18)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La Esferocitosis Hereditaria (ESH) es una anemia hemolítica de observación frecuente, caracterizada por alteraciones cuali y/o cuantitativas –genéticamente determinadas– de las proteínas de la membrana eritrocitaria. Consecuentemente, se debilita la unión entre la membrana eritrocitaria y el citoesqueleto subyacente, produciéndose la pérdida progresiva de la membrana con formación de hematíes de forma esférica, osmóticamente frágiles, que son selectivamente atrapados y destruidos en el bazo. Muchas alteraciones en diferentes genes pueden generar la misma enfermedad. Clínicamente se caracteriza por anemia, ictericia y esplenomegalia. La ESH es la anemia hemolítica hereditaria más frecuente en Argentina. A pesar de ello, es muy escasa la información sobre su comportamiento en nuestro país. Los objetivos de esta tesis son: a) Investigar avances en la metodología de diagnóstico a partir del análisis e implementación de nuevas pruebas que han sido desarrolladas durante la última década; b) Establecer aspectos demográficos de la ESH en la población atendida por nuestro grupo de trabajo; c) Dilucidar algunos mecanismos involucrados en la enfermedad. En este trabajo se utilizaron las pruebas tradicionales (fragilidad osmótica eritrocitaria y prueba de autohemólisis) y se desarrollaron por primera vez en nuestro país las nuevas pruebas diagnósticas (citometría de flujo con 5’eosina maleimida, criohemólisis hipertónica y fragilidad osmótica por citometría de flujo) estableciendo sus puntos de corte, sensibilidad, especificidad y valores predictivos. El análisis de los resultados de los ensayos electroforéticos de las membranas eritrocitarias permitió establecer que las deficiencias de espectrina y ankirina son las prevalentes en nuestra población. En los casos en que fue posible, el estudio se extendió al grupo familiar primario pudiendo detectar portadores sanos y establecer el patrón de herencia. Para poder realizar el diagnóstico en forma precoz, se desarrollaron las nuevas pruebas utilizando sangre capilar, estableciendo la presencia de la patología en neonatos de hasta 2 días de vida. El seguimiento clínico permitió observar la alta frecuencia de crisis hemolíticas asociadas a episodios febriles por lo que se decidió evaluar la posibilidad de que el agravamiento de la anemia fuera debido, en parte, a un efecto directo de la temperatura sobre los esferocitos. Se pudo observar que la hipertermia induce eriptosis mediada por la entrada de calcio a la célula, lo que podría contribuir al empeoramiento de la anemia o al desarrollo de la misma en individuos asintomáticos. La heterogeneidad clínica no pudo relacionarse al tipo de alteración proteica ni a los resultados de las pruebas diagnósticas. En la búsqueda de una alteración en común que pudiera correlacionar con la severidad de la anemia encontramos una expresión disminuida de acuaporina 1 (AQP-1), canal responsable del flujo de agua en el eritrocito, independientemente de la proteína de membrana afectada. El trabajo de tesis presentado implica un avance metodológico por haber desarrollado las nuevas técnicas diagnósticas en nuestro país y haber establecido la equivalencia para realizar los estudios con sangre capilar, conduciendo a un diagnóstico certero y precoz en los neonatos. Los antecedentes y el seguimiento clínico permitieron describir el comportamiento de la enfermedad en los pacientes pertenecientes a nuestra población. Por otra parte, los estudios in vitro, que mostraron sensibilidad de los eritrocitos de los pacientes a la temperatura y asociación de la disminución de AQP-1 en eritrocitos con la severidad de la enfermedad, abren un nuevo camino en la investigación de la esferocitosis hereditaria con una potencial aplicación terapéutica a futuro.

Abstract:
Hereditary spherocytosis (HS) is a common hemolytic anemia, characterized by genetically determined quantitative and/or qualitative abnormalities of the red cell membrane proteins. As a consequence, the connection of skeleton and bilayer gets weakened, loss of membrane surface occurs and changes in red cell lead to the formation of spherical, osmotically fragile erythrocytes, which are selectively trapped and destroyed in the spleen. Diverse mutations in different genes can generate the same disease. HS is characterized by anemia, jaundice, and splenomegaly. Although HS is the most common hereditary hemolytic anemia in Argentina, information concerning its behavior in our country is very scarce. Aims of this thesis are: a) To evaluate advances on diagnostic methodology since the development of new diagnostic tests described throughout the last decade; b) To establish demographics characteristics of HS in the population attended by our working group; c) To elucidate some mechanisms involved in the disease. In this study, standard screening tests –osmotic fragility and autohemolysis– and novel diagnostic tests –eosin-5’maleimide flow cytometry, hypertonic cryohemolysis, and flow cytometric osmotic fragility– were carried out. As these new diagnostic techniques were developed for the first time in our country, their cut-off points, sensitivity and specificity were established. Electrophoresis of membrane proteins established that spectrin and ankyrin are the most frequently found deficiencies in our population. As far as possible, direct relatives were also studied, allowing to detect silent carriers and to establish the inheritance pattern. Novel tests were also developed using capillary blood, to accomplish an earlier diagnosis. So, HS could be diagnosed in neonates aged only 2 days. Patients’ follow-up showed a high frequency of hemolytic crisis associated to febrile diseases. Therefore, we decided to evaluate whether the temperature increment on spherocytes may be one factor responsible for the worsening of hemolysis. Results showed that hyperthermia induced eriptosis mediated by calcium influx to the erythrocyte, which could play a role either for anemia worsening or for anemia development in previously asymptomatic individuals. No correlation between severity of the disease and either deficient protein or results of diagnostic tests could be demonstrated. Searching for an unique factor associated with severity of anemia, a decreased expression of aquaporin-1 (AQP-1), the channel responsible of water influx in the erythrocyte, was found irrespectively of the type of protein deficiency. This thesis implies a methodological advance due to the development for the first time in Argentina of the novel diagnostic tests, as well as the demonstration that they can also be performed with capillary blood, allowing an early and accurate diagnosis in neonates and small infants. Antecedents and clinical follow-up enabled to establish the behavior of the disease in the population of our country. Furthermore, results of in vitro studies showing a harmful effect of hyperthermia on erythrocytes of patients, and association of AQP-1 decrease with severity of the disease, open a new way on HS research with potential future applications.

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Registro:
Título : Esferocitosis hereditaria: avance en la metodología diagnóstica, estudios demográficos e investigación de mecanismos involucrados     =    Hereditary spherocytosis: advance in diagnostic methodology, demographic studies and research on involved mechanisms
Autor : Crisp, Renée Leonor
Director : Nesse, Alcira B.
Consejero : Varone, Cecilia
Jurados : Lazarowski, Alberto J.  ; Feldman, Leonardo  ; García, Verónica E.
Año : 2014-12-18
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Fisiología Celular de la Eritropoyetina
Hospital Nacional Prof. Alejandro Posadas
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5630_Crisp
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biomedicina
Biología / Bioquímica
Palabras claves : ESFEROCITOSIS HEREDITARIA; ERIPTOSIS; ACUAPORINA 1; PROTEINA DE MEMBRANA; ANEMIA HEMOLITICA; HEREDITARY SPHEROCYTOSIS; ERIPTOSIS; AQUAPORIN 1; MEMBRANE PROTEINS; HEMOLYTIC ANEMIA
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