Tesis > Documento


Ver el documento (formato PDF)   Mezzina, Mariela Paula.  "Análisis funcional y estructural de la phasina PhaP de Azotobacter sp. FA-8 y su rol en Escherichia coli recombinante"  (2014-12-04)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
URL:
     
Resumen:
Las phasinas son un grupo de proteínas que se encuentran asociadas a gránulos de polihidroxialcanoatos (PHA). Además de su rol estructural como parte de la cubierta del gránulo, se han encontrado diferentes funciones estructurales y regulatorias asociadas a varias de estas proteínas, y se han desarrollado aplicaciones biotecnológicas utilizando proteínas fusionadas a phasinas. A pesar de su diversidad funcional, la estructura de estas proteínas ha sido analizada en detalle en muy pocos estudios. PhaP de Azotobacter sp. FA8 (PhaPAz) pertenece al grupo más representado de la multifuncional familia de las phasinas. Esta proteína ha sido clonada y expresada en Escherichia coli. Las cepas recombinantes de E. coli que sobreexpresan phaPAz crecen más y acumulan más polímero, lo que sugiere que PhaPAz ejerce un efecto promotor del crecimiento. Se observó también que la expresión de PhaPAz tiene un inesperado efecto protector en E. coli no productora de PHA, tanto en condiciones normales como en condiciones de estrés, resultando en un mayor crecimiento y mayor resistencia a estrés oxidativo y estrés térmico. El objetivo de este trabajo doctoral es realizar una caracterización funcional y estructural de esta phasina para estudiar sus diversas propiedades y dilucidar el mecanismo por el cual ejerce su efecto protector. Su estructura primaria reveló que no posee claros dominios hidrofóbicos, característica que parece ser común a la mayoría de las phasinas, a pesar de su capacidad de unión a gránulos lipídicos. La estructura secundaria de esta proteína consiste en α-hélices, combinadas con regiones desestructuradas que le confieren una notable flexibilidad dependiente del entorno. Los datos experimentales obtenidos revelaron que PhaPAz es un tetrámero formado por interacciones de tipo coiled coil entre los monómeros. Estas características estructurales tambén fueron encontradas en otras phasinas y podrían estar relacionadas con su diversidad funcional. Se realizaron experimentos de actividad chaperona in vitro para dilucidar el mecanismo por el cual PhaPAz ejerce su efecto protector. PhaPAz demostró evitar la agregación térmica de la proteína Citrato Sintasa (CS) y facilitar el proceso de replegado de la enzima luego de la desnaturalización por métodos químicos in vitro. Estos experimentos mostraron que PhaPAz tiene actividad chaperona in vitro. Se utilizaron técnicas de microscopía de fluorescencia y de transmisión electrónica para analizar la localización intracelular de PhaPAz en cepas de E. coli productoras y no productoras de PHB con el objetivo de estudiar el rol de PhaPAz en el plegado de proteínas in vivo, el agregado de proteínas y la dinámica de formación de cuerpos de inclusión. PhaPAz colocalizó con los cuerpos de inclusión de PD, proteína que forma grandes y visibles agregados cuando es sobreexpresada en E. coli. Se observó una reducción en el número de cuerpos de inclusión cuando PD fue coproducida con PhaPAz o con la chaperona GroELS. Estos resultados demuestran que PhaPAz presenta actividad chaperona tanto in vitro como in vivo en E. coli recombinante, y sugieren que las phasinas podrían tener un rol protector general en los productores naturales de PHA. Estas observaciones hacen posible el uso de esta proteína en el desarrollo de nuevas aplicaciones biotecnológicas, como por ejemplo la producción de proteínas recombinantes y otros productos heterólogos en E. coli.

Abstract:
Phasins are a group of proteins associated to granules of polyhydroxyalkanoates (PHAs). Apart from their structural role as part of the PHA granule cover, different structural and regulatory functions have been found associated to many of them, and several biotechnological applications have been developed using phasin protein fusions. Despite their remarkable functional diversity, the structure of these proteins has not been analyzed except in very few studies. PhaP from Azotobacter sp. FA8 (PhaPAz) is a representative of the prevailing type in the multifunctional phasin protein family. This protein has been cloned and expressed in Escherichia coli. Recombinant E. coli strains overexpressing phaPAz grow more, and accumulate more polymer, suggesting that PhaPAz exerts a growth promoting effect. Expression of PhaPAz was also observed to have an unexpected protective effect in E. coli strains that do not synthesize PHAs, under both normal and stress conditions, resulting in increased growth and higher resistance to both superoxide stress and heat shock. The aim of this work was to perform a physiological and structural characterization of this protein, to shed light on its properties. Its secondary structure revealed that it lacks clear hydrophobic domains, a characteristic that appears to be common to most phasins, despite their lipid granule binding capacity. The secondary structure of this protein, consisting of α- helices and disordered regions, has a remarkable capacity to change according to its environment. Several experimental data support that is a tetramer, probably due to interactions between coiled-coil regions. These structural features have also been detected in other phasins, and may be related to their functional diversity. In vitro chaperone activity experiments were performed in order to shed light on the mechanisms by which PhaPAz exerts its protective effect. PhaPAz was shown to prevent in vitro thermal aggregation of the model protein citrate sinthase (CS) and to facilitate the refolding process of the enzyme after chemical denaturation. These experiments showed that PhaPAz presents in vitro chaperone activity. Fluorescence microscopy and electron transmission microscopy were used to analyze the subcellular localization of PhaPAz in PHB producing and non PHB producing E. coli strains and to study the role of PhaPAz in in vivo protein folding, protein aggregation and inclusion body dynamics. PhaPAz was shown to colocalize with inclusion bodies of PD, a protein that forms large inclusion bodies when overexpressed. A reduction in the number of inclusion bodies of PD was observed when the insoluble protein PD was coexpressed with PhaPAz or with the known chaperone GroELS. These results demonstrate that PhaPAz has chaperone like functions both in vitro and in vivo in E. coli recombinants, and suggests that phasins could have a general protective role in natural PHA producers, that in these microorganisms is masked by the fitness enhancing properties of the polymer. These observations open the door for novel biotechnological applications of this protein, for example, in the production of recombinant proteins and other heterologous products in E. coli.

* A este resumen le pueden faltar caracteres especiales. Consulte la versión completa en el documento en formato PDF

Registro:
Título : Análisis funcional y estructural de la phasina PhaP de Azotobacter sp. FA-8 y su rol en Escherichia coli recombinante     =    Functional and structural analysis of the phasin PhaP from Azotobacter sp. FA8 and its role in recombinant Escherichia coli
Autor : Mezzina, Mariela Paula
Director : Pettinari, M. Julia
Wetzler, Diana E.
Consejero : López, Nancy I.
Jurados : Centrón, Daniela  ; Zorreguieta, Angeles  ; Paris, Gastón
Año : 2014-12-04
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Genética y Ecología Microbianas
Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5648_Mezzina
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Bioquímica
URL al Documento : 
URL al Registro : 
hola chau _gs.DocumentHeader_ chau2 _documentheader_ chau3
Estadísticas:
     http://digital.bl.fcen.uba.ar
Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria - Pabellón II - C1428EGA - Tel. (54 11) 4789-9293 int 34