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Ver el documento (formato PDF)   Mardirosian, Mariana Noelia.  "Ecotoxicología del arsénico y mecanismos de acción en el desarrollo del anfibio Rhinella arenarum"  (2015-03-10)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El arsénico (As) es un elemento natural de relevancia ecológica que se encuentra en fuentes naturales de agua en toda la Argentina en concentraciones entre 0,001 y 15 mg/L. La especie autóctona de sapo Rhinella arenarum fue seleccionada para estudiar la toxicidad sub-crónica y crónica del arsénico y las respuestas bioquímicas y moleculares provocadas por la exposición a este tóxico durante su desarrollo embrionario y larval, con el objetivo de identificar biomarcadores moleculares y bioquímicos. El valor promedio de la CL50 fue de 24,27 mg As/L y se mantuvo constante a lo largo del desarrollo embrionario. Sin embargo, cuando los embriones fueron expuestos a partir del estadio de “latido cardíaco” (5 días de desarrollo), la toxicidad del arsénico disminuyó drásticamente, lo que sugiere la activación de mecanismos de desintoxicación. El valor de NOEC arrojó un resultado de 10 mg As/L y el de LOEC (efecto: mortalidad) un valor de 20 mg As/L para los distintos experimentos. Dadas las concentraciones ambientales de arsénico en Argentina, hay una probabilidad de exceder los niveles letales en un 1 por ciento de los sitios. El valor de LOEC sería superado en el 1,3 por ciento de los sitios, mientras que el de NOEC en el 3,5 por ciento de los sitios en términos probabilísticos. El arsénico en concentraciones de 10 y 20 mg/L causó una disminución significativa en la capacidad antioxidante total (TRAP), pero generó un aumento en el contenido de glutatión reducido (GSH) endógeno y en la actividad de glutatión S-transferasa (GST) cuando la exposición se realizó en forma subcrónica hasta el final del desarrollo embrionario. Esta respuesta protectora podría estar impidiendo un descenso más profundo en el sistema antioxidante y un mayor daño oxidativo, o estar vinculado a la conjugación del arsénico con GSH para su excreción. Cuando la exposición a arsénico se realizó en forma crónica durante 23 días a concentraciones por debajo de 10 mg/L, se observó la inducción de las actividades de GST y glutatión reductasa (GR). Por su parte, el arsénico disminuyó la actividad de catalasa (CAT) en los estadios embrionarios, mientras que la actividad de la glutatión peroxidasa Sedependiente no se vio afectada con la presencia del tóxico. Si bien se observó una disminución de TRAP durante toda la exposición a 1 y 10 mg/L, no se observó alteración en el contenido de GSH ni en los niveles de peroxidación de lípidos. La actividad de superóxido dismutasa (SOD) se vio inducida a los 9 y 16 días e inhibida al final de la exposición, sugiriendo la inactivación de la enzima. Se detectó la misma tendencia en la expresión de las proteínas CAT, SOD y GST, analizadas por Western blot, que la observada en sus actividades enzimáticas. Se estudiaron los efectos del arsénico sobre vías de transducción de señales y factores de transcripción que podrían estar relacionados a su toxicidad crónica. Las quinasas de la vía MAPK, MEK y ERK y los factores de transcripción c-FOS y c-JUN fueron inducidos por la exposición a arsénico, pudiendo estar modulando la respuesta antioxidante. Además, se evaluó la acumulación de arsénico y la concentración de hierro, zinc y cobre en embriones y larvas expuestos a arsénico. Los resultados mostraron que los embriones expuestos crónicamente a 1 y 10 mg/L acumularon arsénico a partir del día 5, mientras que los embriones expuestos a 0,01 y 0,1 mg/L lo hicieron entre el día 5 y el día 9 de desarrollo. Luego de 23 días de exposición, se determinó una bioacumulación de arsénico de 27 veces en el grupo expuesto a 0,01 mg/L, de 11 veces en el grupo expuesto a 0,1 mg/L, de 44 veces en el grupo expuesto a 1 mg/L, y de solamente 5 veces en el grupo expuesto a 10 mg/L, tomando como referencia el arsénico presente en el medio. La bioacumulación se comportó de manera lineal en el tiempo de la exposición excepto para el valor más alto de 10 mg/L, concentración que podría provocar la saturación de los sistemas de transporte. El arsénico utilizaría el sistema de excreción de transportadores ABC según los estudios ex vivo que realizamos sobre la actividad de proteínas de resistencia a múltiples xenobióticos, MRP, las cuales transportan en forma fisiológica compuestos conjugados con GSH. Asimismo, se observó un aumento en las concentraciones de hierro, zinc y cobre en las larvas expuestas a arsénico, sugiriendo que el arsénico podría estar modulando la retención o acumulación de estos elementos dentro de las larvas expuestas. Los resultados obtenidos nos permiten concluir que los embriones de R. arenarum son más sensibles al arsénico durante las etapas tempranas del desarrollo, probablemente debido a que se requiere la evolución de mecanismos detoxificantes ligados a GSH; asimismo, altas concentraciones de este elemento son necesarias para provocar la mortalidad cuando la exposición se realiza hasta el final del desarrollo embrionario. El arsénico es capaz de alterar el estado oxidativo en embriones y larvas de R. arenarum, afectando el estado redox celular a concentraciones subletales tanto en la exposición subcrónica como crónica, modulando la respuesta antioxidante a través de la vía de MAPK por MEK y ERK y la acción de los factores de trascripción muy tempranos c-FOS y c-JUN. El arsénico en concentraciones de hasta el orden de mg/L se bioacumularía en forma continua desde el medio, probablemente debido a su transformación enzimática a compuestos organoarsenicales, entre ellos la conjugación con GSH para su excreción por MRP. Además, debido a que la actividad de las enzimas GR y GST, los niveles de proteínas de la vía de MAPK MEK y ERK y de los factores de transcripción c-FOS y c-JUN se vieron alterados a bajas concentraciones de arsénico, su respuesta puede ser utilizada como marcador de exposición temprana a dicho tóxico.

Abstract:
Arsenic (As) is a natural element of ecological relevance that is found in natural water sources throughout Argentina in concentrations ranging between 0.001 and 15 mg/L. The autochthonous toad Rhinella arenarum was selected to study the sub-chronic and chronic toxicity of arsenic and the biochemical responses elicited by the exposure to this toxic in water during its embryonic and larval development, with the aim of identifying molecular and biochemical biomarkers. The LC50 value averaged 24.27 mg/L As, and remained constant along the embryonic development. However, arsenic toxicity drastically decreased when embryos were exposed from “heartbeat” stage on (5 days of development), suggesting the onset of detoxification mechanisms. The NOEC yielded a value of 10 mg/L As, while the LOEC (effect: mortality) yielded a value of 20 mg/L As for the different experiments. Given the environmental concentrations of arsenic in Argentina, there is a probability of exceeding lethal levels at one percent of the sites. The LOEC and NOEC values would be exceeded at 1.3 percent and 3.5 percent of the sites, respectively. Arsenic concentrations of 10 and 20 mg/L caused a significant decrease in the total antioxidant potential (TRAP), but generated an increase in endogenous GSH content and glutathione S-transferase (GST) activity when the exposure was performed sub-chronically until the end of the embryonic development. This protective response might prevent a deeper decline in the antioxidant system and further oxidative damage or it might be linked to arsenic conjugation with GSH for its excretion. When the exposure was performed chronically for 23 days at sublethal concentrations (below 10 mg/L), the toxicant caused an induction of GST and glutathione reductase (GR) activities. However, catalase (CAT) activity was reduced by arsenic in embryonic stages and glutathione peroxidase Se-dependent activity was not affected by the presence of the toxicant. While a decrease in the total antioxidant potential was observed throughout the exposure at 1 and 10 mg/L, GSH content and lipid peroxidation levels did not differ from control. SOD activity was induced after 9 and 16 days of exposure and inhibited at the end of exposure (23 days), suggesting the inactivation of the enzyme. Through Western blot analysis, the same trend was found in the expression of the CAT, SOD and GST proteins when compared to their enzymatic activities. MEK and ERK pathway proteins and signal transduction transcription factors c-JUN and c-FOS were studied, showing that arsenic induces the expression of these proteins suggesting that they might be modulating the antioxidant response due to arsenic exposure. It was observed that embryos exposed chronically to arsenic concentrations between 1 and 10 mg/L accumulate arsenic from day 5 on, and embryos exposed to 0.01 and 0.1 mg/L start accumulating arsenic between day 5 and day 9. After 23 days of exposure, bioaccumulation of arsenic was about 27-fold in the group exposed to 0.01 mg/L, 11-fold in the group exposed to 0.1 mg/L, 44-fold in the group exposed to 1 mg/L, and only 5-fold in the group exposed to 10 mg/L, when compared to the arsenic concentration present in the medium. Bioaccumulation of arsenic was linear along time of exposure except for the highest value of 10 mg/L, suggesting that this concentration could lead to saturation of transport systems. Arsenic would use the ABC transporter excretion system according to our ex vivo studies on the activity of the multidrug resistance proteins, MRP, which transport compounds conjugated with GSH. Furthermore, an increase in the concentrations of iron, zinc and copper in larvae exposed to arsenic was observed, suggesting that arsenic could be modulating the retention or accumulation of these elements in the exposed larvae. We conclude that R. arenarum embryos are more sensitive to arsenic during early stages of development, probably because the development of detoxification mechanisms linked to GSH are necessary and that high concentrations of this toxic element are required to cause mortality when the exposure is performed until the end of the embryonic development. Arsenic can alter the oxidative status in R. arenarum embryos and larvae, affecting the cellular redox state at sublethal concentrations in both sub-chronic and chronic exposures, modulating the antioxidant response via the MAPK pathway, by means of MEK and ERK, and through the action of very early transcription factors, c-FOS and c-JUN. Arsenic at concentrations up to the order of mg/L would continuously be bioaccumulated from the medium, probably due to its enzymatic conversion to organoarsenical compounds, including its conjugation with GSH for excretion via MRP. Furthermore, due to the alteration of GR and GST enzymatic activities, and MEK, ERK, c-JUN and c-FOS levels at low arsenic concentrations, their response can be used as an early marker of exposure to this toxic.

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Registro:
Título : Ecotoxicología del arsénico y mecanismos de acción en el desarrollo del anfibio Rhinella arenarum     =    Ecotoxicology of arsenic and mechanisms of action in the development of the amphibian Rhinella arenarum
Autor : Mardirosian, Mariana Noelia
Director : Venturino, Andrés
Director Asistente : Bongiovanni, Guillermina Azucena
Consejero : Wolansky, Marcelo Javier
Jurados : Ferrari, Lucrecia  ; Menone, Mirta L.  ; Castro, Gerardo D.
Año : 2015-03-10
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad Nacional del Comahue. Facultad de Ingeniería. Departamento de Química. Laboratorio de Investigaciones Bioquímicas y Químicas del Ambiente
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5664_Mardirosian
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Toxicología
Biología / Embriología Animal
Biología / Impacto Ambiental
Palabras claves : RHINELLA ARENARUM; ARSENICO; ECOTOXICIDAD; ESTRES OXIDATIVO; SISTEMA ANTIOXIDANTE; VIAS DE SEÑALIZACION; BIOACUMULACION; RHINELLA ARENARUM; ARSENIC; OXIDATIVE STRESS; ANTIOXIDANT SYSTEM; SIGNALING PATHWAYS; BIOACCUMULATION; ECOTOXICITY
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