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Ver el documento (formato PDF)   Caldarola, Martín.  "Diseño y aplicación de microscopías avanzadas para el estudio de problemas de mecanotransducción celular y nanoplasmónica"  (2015-03-30)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El estudio de problemas que requieren resolución espacial y especificidad química, en condiciones físico-químicas o biológicas altamente controladas, demanda el desarrollo de herramientas específicas, novedosas, versátiles y de plataforma abierta que permitan la libre elección y control de los parámetros relevantes al problema en cuestión. En esta Tesis se han encarado problemas en campos diversos como son la biofísica y la nanofotónica, pero que utilizan una misma plataforma de microscopía avanzada, adaptada especialmente para cada aplicación. En el campo de la biofísica, se estudió la dinámica de formación y remodelado de adhesiones focales (FA). Las FAs son complejos multiproteicos que sirven a la célula como puntos de anclaje en la matriz extracelular. Su proceso de formación consta de distintas etapas y escalas temporales que dependen sustancialmente de las fuerzas aplicadas a la célula. Para poder estudiar y entender este complejo proceso, altamente dinámico, es necesario realizar mediciones precisas de las fuerzas involucradas y poder correlacionarlas con la respuesta bioquímica de la célula. Se presenta una técnica que permite obtener información cuantitativa de la respuesta de células vivas a estímulos mecánicos locales y con especificidad molecular, basada en la combinación de un microscopio de fuerza atómica (AFM), con un microscopio óptico de fluorescencia. Con esta técnica se estudiaron proteínas citosólicas presentes en las adhesiones focales, tales como vinculina, FAK y zixina. Se observó la formación de una adhesión focal naciente en el caso de la vinculina, se cuantificó el tiempo de reclutamiento para la FAK y se estudió la distribución espacial de la zixina en adhesiones focales maduras. Estos resultados muestran la utilidad de este desarrollo para el estudio de procesos biofísicos complejos involucrados en la mecanotransducción celular. En el campo de la nanofotónica y en particular de la nanoplasmónica, las llamadas nanoantenas metálicas han sido ampliamente utilizadas en los últimos años para intensificar y confinar la luz en volúmenes muy pequeños. Sus diversas aplicaciones van desde el sensado molecular hasta las microscopías de alta resolución. La intensificación local del campo electromagnético se debe a la excitación resonante de los llamados plasmones superficiales en los metales nanoestructurados. Sin embargo, uno de los problemas fundamentales de este esquema consiste en la altísima generación de calor en la nanoesacala, producida por la excitación resonante. La plataforma multifunción desarrollada en esta Tesis admite ser utilizada en la configuración de microscopio confocal de doble haz, que permite el control independiente de la generación de calor en la nanoantena, producido por uno de esos haces. La mencionada configuración fue utilizada en dos problemas de nanoplasmónica relacionados: A) el desarrollo y prueba de principios de un nuevo esquema de sensado molecular, que utiliza como mecanismo de sensado el calentamiento plasmónico de nanocilindros de oro y la consecuente dependencia de la intensidad de fluorescencia con la temperatura. B) El desarrollo de un método de mapeo térmico de alta resolución basado en la disminución de la intensidad de fluorescencia de un film polimérico dopado con moléculas fluorescentes y depositado sobre la muestra a estudiar. Con este método se estudió y comparó el desempeño de nanoantenas plasmónicas metálicas y semiconductoras, arrojando como resultado que las semiconductoras alcanzan menores temperaturas que las metálicas. Esto demuestra que las nanoantenas semiconductoras podrían utilizarse en esquemas de sensado ultrasensible, como ser SERS, sin afectar la muestra por calentamiento. Finalmente, se construyó y caracterizó una fuente de luz solitónica sintonizable por potencia, basada en una fibra óptica de cristal fotónico (PCF), que sirve como fuente de luz alternativa para el microscopio confocal. Se mostró que el ancho de pulso de los solitones se mantiene constante para todo el rango de sintonizabilidad (860-1200 nm) en un valor de 45 fs. También se muestra la robustez de esta fuente de luz ante variaciones del chirp del pulso de entrada. Las particulares características de esta fuente de luz, principalmente su amplia y rápida sintonizabilidad, abre diversas alternativas para el estudio de propiedades físico-químicas de materiales así como propiedades bioquímicas en sistemas biológicos. Palabras clave: Microscopías ópticas de fluorescencia. Microscopía de Fuerza Atómica. Mecanotransducción celular. Nano-antenas. Solitones en fibras ópticas de cristal fotónico.

Abstract:
The study of problems that require both spatial resolution and chemical specificity demands the development of specific and adaptable tools for the relevant variables of each problem. In this thesis we have studied two problems from different fields such as biophysics and nanophotonics, using the same platform of advanced microscopy. In the biophysics field, we studied the dynamics of formation and remodeling of Focal Adhesions (FA). FAs are multiprotein complex the cell creates to anchor to the extra cellular matrix. This adhesion process is a highly dynamic force-dependent process that evolves at several temporal scales. An understanding of this process requires precise measurements of forces and its correlation with the biochemical responses in living cells. We present a method that allows to access quantitatively information about live cell responses when a controlled, local and specific mechanical stimulus is applied to live cells. This approach combines atomic force microscopy (AFM) with fluorescence imaging. Using this combined technique, we studied the recruitment of adhesion proteins such as vinculin, FAK and zyxin triggered by applying forces in the nN regime. We observed the development of a nascent adhesion site, which was evident from the accumulation of vinculin at the position where the force was applied. In addition, we quantified the recruitment time for FAK in the formation of a new adhesion site, and analyzed the zyxin spatial distribution remodeling in mature focal adhesion as a function of the applied force. We have demonstrated that this method is a useful tool for the study of a variety of complex biological processes involved in cellular mechanotransduction. In nanophotonics and particularly in nanoplasmonics field, we studied metallic nanoantennas, which have recently been widely used to enhance and confine light in nanometric volumes. Nanoantennas have been proved to be useful in a variety of applications that range from molecular sensing to high resolution microscopies. The local field enhancement is due to so called plasmonic resonances, produced by the collective oscillation of the conducting electrons in metals. However, there is a fundamental problem with this scheme: metallic structures suffer from ohmic losses, leading heating of the structure and its local environment. The multipropose platform developed in this thesis includes a dual beam confocal microscope, which allows the use of one laser to control the heat generation independently from the fluorescence excitation. This configuration was used in two related nanopalsmonic problems: A) the development and proof of principles of a new molecular sensing scheme, based in the plasmonic heating of gold nanorods and its consequent decrease in the fluorescence intensity. B) The development of a method of thermal mapping based in the decrease of fluorescence intensity with increasing temperature, using a polimeric thin film with fluorophores embedded deposited on the samples. We compared the temperature increase in gold and silicon nanoantennas when they are illuminated by a near infrared laser and we show lower temperature increase in the semiconductor structures. This fact demonstrates that semiconductor nanoantennas, unlike the metallic, can be used in ultra-sensitive schemes such as SERS without heating the sample. In addition, we built and characterized a high-speed wavelength tunable photonic crystal fiber-based source, capable of generating tunable femtosecond solitons in the infrared region. This unique light source can be used as an alternative excitation source for the confocal configuration. Through measurements and numerical simulation, we show that both the pulsewidth and the spectral width of the output pulses remain nearly constant over the entire tuning range (860 to 1200 nm). We also show that this source is insensitive to chip variations in the pump pulse, even in the case of heavily chirped pulses. All these remarkable properties open up diverse alternatives to study physical and chemical properties of materials as well as biochemical properties in biological systems. Key words: Optical fluorescence Microscopy. Atomic Force Microscopy. Cellular mechanotransduction. Nanoantennas. Solitons in pohtonic crystal fibers.

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Registro:
Título : Diseño y aplicación de microscopías avanzadas para el estudio de problemas de mecanotransducción celular y nanoplasmónica     =    Design and application of advanced microscopies for problems in cellular mechanotransduction and nanoplasmonics
Autor : Caldarola, Martín
Director : Bragas, Andrea V.
Consejero : Grosz, Diego F.
Jurados : Larotonda, Miguel  ; Scaffardi, Lucía  ; Aramendia, Pedro
Año : 2015-03-30
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Física. Laboratorio de Electrónica Cuántica
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Físicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5716_Caldarola
Idioma : Español
Area Temática : Física / Óptica Cuántica
Física / Biofísica
Física / Fotofísica
Palabras claves : MICROSCOPIAS OPTICAS DE FLUORESCENCIA; MICROSCOPIA DE FUERZA ATOMICA; MECANOTRANSDUCCION CELULAR; NANO-ANTENAS; SOLITONES EN FIBRAS OPTICAS DE CRISTAL FOTONICO; OPTICAL FLUORESCENCE MICROSCOPY; ATOMIC FORCE MICROSCOPY; CELLULAR MECHANOTRANSDUCTION; NANOANTENNAS; SOLITONS IN PHOTONIC CRYSTAL FIBERS
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