Tesis > Documento


Ver el documento (formato PDF)   Pérez, Juliana Andrea.  "Caracterización genómica y funcional de los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 que codifican para proteínas de tipo acuaporinas en Arabidopsis thaliana"  (2015-03-25)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
URL:
     
Resumen:
En las Angiospermas, la reproducción incluye procesos en los cuales el transporte de agua está espacial y temporalmente regulado. Durante la microgametogénesis del polen, el contenido de agua del grano de polen comienza a aumentar de manera significativa desde el estadio temprano de la microespora y continúa haciéndolo hasta la deshidratación parcial. El volumen de polen, al igual que el contenido de agua, disminuye durante la deshidratación de las anteras y el polen, se adapta a las condiciones ambientales durante la dispersión y aumenta durante la rehidratación en el estigma. En plantas con estigmas secos, la regulación de la rehidratación del polen proporciona una barrera temprana y eficaz para las polinizaciones incompatibles. El agua, los nutrientes y otras moléculas pequeñas son transportados rápidamente desde las papilas estigmáticas al grano de polen para promover su germinación por mecanismos que aún no se conocen completamente. Luego durante la elongación del tubo polínico, la entrada adicional de agua a través de la membrana plasmática permite el ajuste citosólico de iones (Ca2+, K+, H+ y Cl–) y de la presión de turgencia. Se ha propuesto que las acuaporinas estarían involucradas en el transporte de agua y/o solutos durante la germinación del polen y el crecimiento del tubo polínico. En Arabidopsis thaliana sólo 4 genes (de un total de 35 loci) se expresan específicamente en los granos de polen maduros y/o tubos polínicos: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 y AtNIP4;2. En este trabajo de tesis se demuestra la participación de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 en los procesos asociados a la reproducción. Los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 presentan alta identidad de secuencia nucleotídica, estructura génica similar (5 exones, 4 intrones) y están dispuestos en tándem. A nivel de proteínas, tienen un 84% de identidad aminoacídica, y comparten los mismos dos motivos NPA y el filtro de constricción ar/R (W, V, A, R), involucrados en la selectividad del transporte. Sin embargo, AtNIP4;1 y AtNIP4;2 muestran diferentes patrones de expresión. Ensayos de PCR en tiempo real demostraron que AtNIP4;1 tiene niveles relativos de expresión bajos en polen maduro y que AtNIP4;2 presenta un pico de expresión durante la elongación del tubo polínico. Además, flores transgénicas promotorNIP4;1::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS en los granos de polen maduros y persistente en los tubos polínicos, mientras que las flores promotorNIP4;2::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS solamente en el tubo polínico. Por lo tanto, nuestra hipótesis es que AtNIP4;1 y AtNIP4;2 podrían tener redundancia funcional durante la reproducción, pero desempeñar roles diferentes y específicos en el desarrollo del polen, la polinización y/o fertilización. Con el objetivo de llevar a cabo experimentos fisiológicos in vitro e in planta, se obtuvieron plantas mutantes simples de inserción de ADN-T y se generaron líneas amiARN doble knockdown. Las plantas simple mutante y doble knockdown mostraron parámetros de fertilidad afectados: reducción del número de semillas por silicua y segregación distorsionada asociada solamente al gametofito masculino. Además, las plantas doble knockdown mostraron reducción de la viabilidad y del diámetro de los granos de polen maduros, aumento del número de granos de polen inmaduros (granos de polen uni y bi-celulares), defectos en la rehidratación de polen, reducción de la tasa de germinación y de la longitud del tubo polínico (especialmente en condiciones limitantes de ácido bórico), y aumento del porcentaje de las flores no polinizadas. También se generaron líneas de complementación que expresan las proteínas de fusión eGFPAtNIP4; 1 y eGFP-AtNIP4;2 bajo sus promotores endógenos en el background de sus respectivas líneas simple mutantes. Los análisis de segregación demostraron que estas líneas de complementación rescatan el fenotipo mutante. Además, mediante microscopía confocal se observó que la proteínas de fusión eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 están localizadas en la membrana plasmática y en vesículas intracelulares de los granos (AtNIP4;1) y tubos polínicos (AtNIP4;1 y AtNIP4;2). Ensayos de expresión heteróloga de eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 en ovocitos de Xenopus laevis confirmaron que ambas acuaporinas presentan una baja permeabilidad al agua y un significativo transporte de glicerol. Ensayos de actividad quinasa in vitro demostraron que los dominios C-terminales de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 son fosforilados específicamente en Ser267 por AtCPK34, una proteína quinasa dependiente de calcio expresada en polen, sugiriendo que la fosforilación puede regular su actividad de transporte in planta. En resumen las evidencias obtenidas en esta tesis doctoral permiten sugerir que AtNIP4;1 estaría involucrada principalmente en las etapas del desarrollo del polen, polinización y germinación, y AtNIP4;2 tendría un rol preponderante en la elongación del tubo polínico. Palabras claves: acuaporinas de polen, transporte de agua, reproducción

Abstract:
In Angiosperms, reproduction involves processes where water and solutes transport is temporally and spatially regulated. During pollen development, pollen water content starts increasing significantly at the early microspore stage and continues to increase until partial dehydration. Then, pollen volume decreases during anther and pollen dehydration and, similar to water content, adapts to environmental conditions during dispersal, increasing later during rehydration. In plants with dry stigmas, regulated pollen hydration provides an effective early barrier to incompatible pollinations. Water, nutrients, and other non-polar small molecules are transported rapidly into pollen from the stigma papillae to promote its germination by mechanisms that are still unknown. Then, additional entry of water through the plasma membrane allows cytosolic adjustment of ions (Ca2+, K+, H+, and Cl–) and maintenance of turgor pressure during tip elongation. It has been proposed that aquaporins may mediate water and solute transport during pollen germination and pollen tube growth. In Arabidopsis thaliana only 4 genes (out of 35 loci) are specifically expressed in mature pollen grains and/or pollen tubes: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 and AtNIP4;2. Here, we show the involvement of AtNIP4;1 and AtNIP4;2 in reproduction processes. Interestingly, AtNIP4;1 and AtNIP4;2 are genes with high nucleotide sequence identity, similar gene structure (5 exons, 4 introns), and disposed in tandem. At protein level, they have 84% amino acidic identity, and share the same two NPA motifs and the ar/R constriction (W,V,A,R), involved in transport selectivity. However, they displayed different expression patterns. Real time PCR assays showed that AtNIP4;1 has low relative expression levels in mature pollen while AtNIP4;2 peaks during pollen tube elongation. Additionally, NIP4;1promoter::GUS flowers showed strong GUS activity in mature pollen grains, remaining in the pollen tubes, whereas NIP4;2promoter::GUS flowers, showed strong GUS activity upon pollen tube germination. Therefore, we hypothesized that they could have a functional redundancy during reproduction, even though they may play different roles in pollen development, pollination and/or fertilization. In order to perform in vitro and in planta physiological experiments, we obtained simple mutant T-DNA insertion lines and developed double knockdown amiRNA lines. Simple mutant and double knockdown plants showed affected fertility parameters: reduced number of seeds per silique, and distorted segregation ratios. Furthermore, double knockdowns displayed reduced mature pollen grain viability and diameter, increased number of immature pollen grains (increased number of pollen grains arrested at uni- and bi-cellular stages), defects in pollen rehydration, reduced germination rate and pollen tube length (specially under low boric acid conditions), and increased percentage of non-pollinated flowers. Complementation lines expressing eGFP-tagged AtNIP4;1 and AtNIP4;2 under their own promoters, in each mutant line background, rescued the mutant phenotype in segregation analysis. Additionally, confocal microscopy showed that eGFP-AtNIP4;1 and -AtNIP4;2 are localized in the plasma membrane and intracellular vesicles of pollen grains (AtNIP4;1) and tubes (AtNIP4;1 and AtNIP4;2). Functional expression of eGFP-AtNIP4;1 and eGFP-AtNIP4;2 in Xenopus laevis oocytes confirmed that both aquaporins have relatively low water permeability and significant glycerol transport. In vitro kinase assays showed that the C-terminal domains of AtNIP4;1 and AtNIP4;2 are specifically phosphorylated at Ser267 by AtCPK34, a pollen Calcium-dependent protein kinase, suggesting that phosphorylation might regulate their transport activity in planta. In summary, the obtained results suggest that AtNIP4;1 might be involved mainly in pollen development, pollination, and germination, and AtNIP4;2 could play a major role in pollen tube elongation. Keywords: aquaporins, pollen, water transport, reproduction

* A este resumen le pueden faltar caracteres especiales. Consulte la versión completa en el documento en formato PDF

Registro:
Título : Caracterización genómica y funcional de los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 que codifican para proteínas de tipo acuaporinas en Arabidopsis thaliana     =    Genomic and functional analysis of AtNIP4;1 and AtNIP4;2 genes which code for aquaporin proteins in Arabidopsis thaliana
Autor : Pérez, Juliana Andrea
Director : Muschietti, Jorge P.
Director Asistente : Soto, Gabriela C.
Consejero : Muschietti, Jorge P.
Jurados : Cerdán, Pablo  ; Asurmendi, Sebastián  ; Goldriaj, Ariel
Año : 2015-03-25
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular ¨Dr. Héctor N. Torres¨ (INGEBI)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5722_Perez
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Genética
Biología / Fisiología Vegetal
Palabras claves : ACUAPORINAS DE POLEN; TRANSPORTE DE AGUA; REPRODUCCION; AQUAPORINS; POLLEN; WATER TRANSPORT; REPRODUCTION
URL al Documento : 
URL al Registro : 
hola chau _gs.DocumentHeader_ chau2 _documentheader_ chau3
Estadísticas:
     http://digital.bl.fcen.uba.ar
Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria - Pabellón II - C1428EGA - Tel. (54 11) 4789-9293 int 34