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Ver el documento (formato PDF)   González Bardeci, Nicolás Diego.  "Estructura y función del dominio D/D de la subunidad regulatoria de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae"  (2015-03-25)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) es una quinasa de serina y treonina de amplio espectro que fosforila a sus proteínas blanco en respuesta a estímulos específicos. Se encuentra involucrada en la regulación de una gran diversidad de procesos fisiológicos en una amplia variedad de organismos, motivo por el cual es un miembro modelo de estudio de la superfamilia de las Proteínas Quinasa. En la mayoría de los organismos, en condiciones de baja concentración de cAMP existe como una holoenzima inactiva heterotetramérica conformada por dos subunidades catalíticas (C) y un dímero de subunidades regulatorias (R). En respuesta a estímulos extracelulares específicos, las concentraciones intracelulares del segundo mensajero aumentan; como consecuencia, dos moléculas de cAMP se unen a cada subunidad R, generando un cambio conformacional que disocia la holoenzima en un dímero de subunidades R y dos subunidades C activas. En mamíferos existen cuatro isoformas de la subunidad R, que presentan una estructura de dominios bien conservada entre los distintos organismos. Ésta consiste de dos dominios de unión a cAMP hacia el extremo C-terminal, y una región responsable de la dimerización hacia el extremo N-terminal. Esta pequeña región de apenas 50 aminoácidos se denomina dominio de dimerización y anclaje (D/D), ya que constituye además una superficie de interacción para una familia de proteínas denominadas AKAPs (A-Kinase Anchoring Proteins). Estas proteínas tienen como función proporcionar a la holoenzima de la PKA la localización subcelular necesaria para garantizar la propagación adecuada de las señales disparadas por cAMP. Todas ellas presentan una hélice anfipática de unos 20 aminoácidos cuya cara no polar interactúa con alta afinidad con una superficie hidrofóbica proporcionada por los dominios D/D. Se conocen las estructuras de alta resolución de los dominios D/D de mamíferos, tanto en su forma apo como en complejo con péptidos derivados de distintas AKAPs. Sin embargo, hasta la fecha no se han llevado a cabo estudios estructurales de estos dominios en otros organismos. El objetivo principal de este trabajo consiste en obtener una caracterización estructural y funcional del dominio D/D de Bcy1, la subunidad R de la PKA de S. cerevisiae. La motivación principal radica en contribuir con el primer estudio de estos dominios en organismos no mamíferos, a efectos de establecer una comparación con éstos. S. cerevisiae es un organismo modelo por excelencia en bioquímica y biología molecular, y resulta muy pertinente para este trabajo dado que en este organismo la PKA es una enzima fundamental involucrada en la regulación de los procesos relacionados con la respuesta a la disponibilidad de nutrientes, respuesta a estrés, desarrollo y entrada en fase estacionaria. En primer lugar, se realizó un mapeo del dominio D/D de Bcy1 por análisis bioinformático de secuencias y experimentos de entrecruzamiento químico utilizando mutantes de deleción de Bcy1 en su extremo N-terminal. En segundo lugar, se procedió al clonado, sobreexpresión en bacterias, y desarrollo de un protocolo de purificación del fragmento recombinante Bcy1 1-50. Posteriormente, se procedió a su caracterización estructural, para lo cual se utilizaron dos abordajes generales: estudiar la estructura en solución y elucidar la estructura cristalina. Para la primera parte, se determinó el estado oligomérico en solución y se obtuvieron parámetros hidrodinámicos característicos utilizando cromatografía de exclusión molecular (SEC), dispersión estática de la luz (SLS) y dispersión de rayos X a bajo ángulo (SAXS). Por otro lado, se estudió la estructura secundaria utilizando dicroísmo circular (CD). Finalmente, se construyó un modelo de la estructura en solución consistente con los datos experimentales, mediante herramientas de modelado molecular. En segundo lugar, se logró resolver la estructura cristalina utilizando difracción por rayos X (XRD). Recientemente, en nuestro grupo de investigación se han identificado varias proteínas interactoras de Bcy1. Estas proteínas son consideradas “candidatas” a ser las primeras AKAPs reportadas en levaduras. Para concluir este trabajo, se estudió la interacción entre el fragmento Bcy1 1-50 y un péptido sintético derivado de una de estas proteínas, Ira2. Para ello se utilizaron técnicas de dicroísmo circular y espectroscopía de fluorescencia.

Abstract:
The cAMP dependent protein kinase (PKA) is a broad spectrum serine/threonine kinase which phosphorylates its target proteins in response to specific stimuli. It is involved in the regulation of a great diversity of physiological processes in many organisms. Therefore, it is a model member of study of the Protein Kinase superfamily. In most organisms, when cAMP levels are low, it exists as an inactive heterotetrameric holoenzyme which is formed by two catalytic (C) subunits and a regulatory (R) subunit dimer. In response to specific extracellular stimuli, the intracellular concentrations of the second messenger rise; as a consequence, two molecules of cAMP bind each R subunit, thus triggering a conformational change that dissociates the holoenzyme in an R subunit dimer and two active C subunits. In mammals there exist four isoforms of the R subunit, which present a well conserved domain structure among many organisms. It consists of two cAMP binding sites at the Cterminus, and a region responsible for dimerization at the N-terminus. This small region of 50 amino acids is called the dimerization and docking (D/D) domain since it presents a surface for interaction with proteins of the AKAP (A-Kinase Anchoring Proteins) family. These proteins are responsible for the appropriate subcellular localization of the holoenzyme, which is required for the propagation of the signaling events triggered by cAMP. They all present an amphipathic helix of 20 amino acids with a non-polar face that interacts with high affinity with a hydrophobic surface in the D/D domains. The high resolution structures of mammalian D/D domains are well known, both in their apo forms and in the AKAP peptide complex. However, to date no structural studies of these domains in other organisms have been performed. The main goal of this work consists in performing a structural and functional characterization of the D/D domain of Bcy1, the R subunit of PKA from S. cerevisiae. The motivation for this work consists in contributing with the first structural study of these domains in non-mammalian organisms, in order to compare with mammalian features. S. cerevisiae is a prototypic organism in biochemistry and molecular biology, and it is of great interest for this work because PKA is a key enzyme involved in the regulation o nutrient availability, stress response, development and entry into stationary phase. As a first approach, we performed a mapping of the D/D domain of Bcy1 using sequence analysis and chemical crosslinking experiments with deletion mutants of the N-terminus of Bcy1. Secondly, we cloned, overexpressed, and purified a recombinant fragment, Bcy1 1-50. Finally, we proceeded with its structural characterization, which consisted of two general approaches: to study the solution structure and the crystal structure. For the solution structure analysis, we determined the oligomeric state and obtained hydrodynamic parameters using size-exclusion chromatography (SEC), static light scattering (SLS), and small-angle X-ray scattering (SAXS). On the other hand, we studied the secondary structure using circular dichroism (CD). Finally, we generated a model of the solution structure which is consistent with the experimental data, using molecular modelling tools. Finally, we solved the crystal structure using X-ray diffraction (XRD). Recently, in our group, several proteins that interact with Bcy1 have been identified. These proteins are considered “candidates” to be the first AKAPs reported in yeast. To conclude this work, we studied the interaction between the fragment Bcy1 1-50 and a synthetic peptide derived from one of these proteins, Ira2. To accomplish this goal, we used CD and fluorescence spectroscopy techniques.

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Registro:
Título : Estructura y función del dominio D/D de la subunidad regulatoria de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae     =    Structure and function of the D/D domain of the regulatory subunit of protein kinase A in Saccharomyces cerevisiae
Autor : González Bardeci, Nicolás Diego
Director : Moreno de Colonna, Silvia Margarita
Director Asistente : Rossi, Silvia Graciela
Consejero : Moreno de Colonna, Silvia Margarita
Jurados : Estrin, Darío A.  ; Wetzler, Diana E.  ; Ceccarelli, Eduardo A.
Año : 2015-03-25
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica e Instituto de Química Biológica. Laboratorio de Transducción de Señales
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5746_GonzalezBardeci
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Biológica
Palabras claves : PROTEINA QUINASA A; SACCHAROMYCES CEREVISIAE; BCY1; PROTEINAS DE ANCLAJE DE LA QUINASA A; DICROISMO CIRCULAR; DISPERSION DE RAYOS X A BAJO ANGULO; ESTRUCTURA CRISTALINA; PROTEIN KINASE A; SACCHAROMYCES CEREVISIAE; BCY1; A-KINASE ANCHORING PROTEINS; CIRCULAR DICHROISM; SMALL-ANGLE X-RAY SCATTERING; CRYSTAL STRUCTURE
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