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Ver el documento (formato PDF)   Beltrán González, Andrea Natalia.  "Modulación de los receptores GABA Ap1 por especies reactivas del oxígeno y benzodiazepinas"  (2015-03-26)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Las especies reactivas del oxígeno (ROS) se asocian generalmente con estrés oxidativo celular, pero también tienen un importante rol como mensajeros celulares en la señalización redox, por ejemplo, modulando la actividad de los receptores de neurotransmisores y canales iónicos. Hasta el momento no se habían demostrado acciones directas de las ROS sobre los receptores GABAA. En este trabajo se estudiaron los efectos de las ROS sobre la función del receptor GABAAρ1. Se expresaron receptores homoméricos GABAAρ1 humanos en oocitos de Xenopus laevis y se registraron electrofisiológicamente las respuestas evocadas por GABA en presencia o ausencia de ROS. Las respuestas GABAAρ1 se potenciaron significativamente en presencia de H2O2, en forma reversible y dosis dependiente. Los efectos potenciadores se atenuaron en presencia de un scavenger de radicales libres, ácido lipoico, y un inhibidor de la reacción de Fenton, deferoxamina. Para identificar los residuos involucrados en las acciones de las ROS se realizaron ensayos de protección química de cisteínas con agentes selectivos de sulfhidrilos y mutagénesis sitio dirigida. Cada subunidad ρ1 contiene solo tres residuos de cisteína, dos extracelulares en el Cys-loop (C177 y C191) y una intracelular (C364) en el bucle TM3-TM4. La sustitución de la C364 por alanina o serina generó receptores mutantes completamente insensibles a la potenciación por ROS. Las cisteínas del Cys-loop no resultaron esenciales para la modulación por ROS. Nuestros resultados muestran que las ROS potencian la función de los receptores de GABAAρ1 y que la cisteína intracelular C364 es el sensor para las acciones de ROS. Por otro lado, varios subtipos de receptores GABAA son modulados alostéricamente por benzodiazepinas (BZD), drogas ampliamente usadas como ansiolíticos, hipnóticos sedantes y anticonvulsivos. Se identificó un sitio de unión a BDZs de alta afinidad y al menos tres sitios adicionales de baja afinidad en variantes heteroméricos y homomericos de receptores GABAA. Sin embargo, nunca se había reportado la modulación de receptores GABAAρ1 por BDZs y durante mucho tiempo se los asumió como completamente insensibles. En el presente estudio, se expresaron heterólogamente receptores GABAAρ1 en oocitos y se registraron las respuestas evocadas por GABA en presencia y ausencia de BDZs. El diazepam y 4'-Cl diazepam modularon las respuestas GABAAρ1 en el rango micromolar de forma reversible, dependiente de la concentración e independiente del voltaje. El diazepam potenció las corrientes de Cl- evocadas por GABA y el 4'- Cl diazepam produjo efectos bifásicos dependiendo de la concentración de GABA, mientras que Ro15-4513 y alprazolam actuaron como moduladores negativos. Las acciones de las BDZs resultaron insensibles a flumazenil. Otras BZDs no mostraron actividad significativa en condiciones experimentales equivalentes. Nuestros resultados sugieren que las BZDs pueden modular la función del receptor GABAAρ1 de forma selectiva y diferencial.

Abstract:
Reactive oxygen species (ROS) are normally involved in cell oxidative stress but also play a role as cellular messengers in redox signaling, for example modulating the activity of neurotransmitter receptors and ion channels. However, the direct actions of ROS on GABAA receptors were not previously demonstrated. In the present work, we studied the effects of ROS on GABAAρ1 receptor function. Human homomeric GABAAρ1 receptors were expressed in Xenopus laevis oocytes and GABA-evoked responses electrophysiologically recorded in the presence or absence of ROS. GABAAρ1 receptor-mediated responses were significantly enhanced in a dose-dependent and reversible manner by H2O2. Potentiating effects were attenuated by a free radical scavenger, lipoic acid, or an inhibitor of the Fenton reaction, deferoxamine. Chemical protection of cysteines by selective sulfhydryl reagents and site-directed mutagenesis studies were used to identify protein residues involved in ROS actions. Each ρ1 subunit contains only three cysteine residues, two extracellular at the cys loop (C177 and C191) and one intracellular (C364) at the TM3-TM4 linker. Mutant GABAAρ1 receptors in which C364 was exchanged by alanine or serine were completely insensitive to ROS potentiation implying that this site, rather than a cystein in the Cys-loop, is essential for ROS modulation. Our results show that the function of GABAAρ1 receptors is enhanced by ROS and that the intracellular C364 is the sensor for ROS actions. On the other hand, many GABAA receptor subtypes are allosterically modulated by benzodiazepines (BDZs), which are drugs extensively used as anxiolytics, sedative-hypnotics and anticonvulsants. One high-affinity site and at least three additional low-affinity sites for BDZ recognition have been identified in several heteromeric and homomeric variants of the GABAA receptors. However, the modulation of homomeric GABAAρ1 receptors by BDZs was not previously revealed, and these receptors, for a long a time, were assumed to be fully insensitive to the actions of these drugs. In the present study, GABAAρ1 receptors were heterologously expressed in oocytes and GABA-evoked responses electrophysiologically recorded in the presence or absence of BDZs. GABAAρ1 receptor-mediated responses were modulated by diazepam and 4´-Cl diazepam in the micromolar range, in a concentration-dependent, voltage-independent and reversible manner. Diazepam produced potentiating effects on GABA-evoked Cl- currents and 4´-Cl diazepam induced biphasic effects depending on the GABA concentration, whereas Ro15-4513 and alprazolam were negative modulators. BDZ actions were insensitive to flumazenil. Other BDZs showed negligible activity at equivalent experimental conditions. Our results suggest that GABAAρ1 receptor function can be selectively and differentially modulated by BDZs.

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Registro:
Título : Modulación de los receptores GABA Ap1 por especies reactivas del oxígeno y benzodiazepinas     =    Modulation of GABA Ap1 receptors by reactive oxygen species and benzodiazepines
Autor : Beltrán González, Andrea Natalia
Director : Calvo, Daniel Juan
Consejero : Katz, Eleonora
Jurados : Szczupak, Lidia  ; Raingo, Jesica  ; Gelman, Diego
Año : 2015-03-26
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular ¨Dr. Héctor N. Torres¨ (INGEBI)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5761_BeltranGonzalez
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : RECEPTOR GABA A; RECEPTOR GABA AP1; ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO; BENZODIAZEPINAS; RETINA; GABA A; RECEPTOR; GABA AP1 RECEPTOR; REACTIVE OXYGEN SPECIES; BENZODIAZEPINES; RETINA
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