Tesis > Documento


Ver el documento (formato PDF)   Pérez Ipiña, Emiliano.  "Análisis y modelado de experimentos de fluorescencia. Aplicación a señales de calcio"  (2015-10-22)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
URL:
     
Resumen:
En este trabajo se estudian, desde un punto de vista teórico, distintas técnicas ópticas que permiten observar in vivo procesos que ocurren en células y embriones. Todas ellas involucran la obtención de registros o imágenes de fluorescencia. Uno de los objetivos del trabajo es determinar cómo analizar los datos experimentales para extraer información cuantitativa sobre parámetros biofísicos relevantes para los fenómenos observados. En particular, se analiza cómo hacerlo cuando las moléculas observadas difunden e interactúan (reaccionan) con otras especies. En los distintos casos analizados las fluctuaciones de los registros o imágenes cumplen un rol fundamental ya que se usan para extraer información. En base al conocimiento construido a partir del estudio de las fluctuaciones en experimentos de fluorescencia, en el presente trabajo se avanza también sobre otro aspecto relevante para los procesos de señalización biológica como es el tiempo que le lleva a un mecanismo celular endógeno “sensar” la concentración de un ligando con un dado nivel de error. En la primera parte de la Tesis se hace foco en el estudio de la técnica conocida como Espectroscopía por Correlación de Fluorescencia (FCS, por su nombre en inglés). En los experimentos de FCS se obtienen registros de fluorescencia en un pequeño volumen a partir de los cuales se calcula la función de autocorrelación (ACF) de las fluctuaciones de la fluorescencia. Ajustando la ACF es posible extraer los tiempos de correlación que la caracterizan y los pesos con que entran dichos tiempos. Usando un modelo dinámico de los procesos que subyacen a las observaciones es posible pasar de los parámetros de ajuste a parámetros biofísicos. En particular, a partir de los tiempos de correlación pueden estimarse las tasas de transporte de las moléculas marcadas y, a partir de los pesos, puede obtenerse información sobre la concentración de las moléculas observadas. En el Capítulo 2 se estudia de qué modo, para un sistema de moléculas marcadas que reaccionan y difunden, los tiempos de correlación dependen de los parámetros del sistema y de los del experimento. Se muestra, en particular, cómo variando el volumen de observación los tiempos característicos pasan de estar determinados exclusivamente por los coeficientes de difusión libre de las especies involucradas a depender de coeficientes efectivos que son función de las tasas de reacción. En el Capítulo 3 se estudia la variación de la ACF dependiendo de si las moléculas marcadas interactúan con sitios móviles o inmóviles. Se observa que en el caso de sitios inmóviles hay un tiempo de correlación cuyo peso se anula lo que tiene implicancias directas sobre la estimación de concentraciones a partir de los experimentos. En este Capítulo se estudia también con qué precisión es posible estimar concentraciones dependiendo de la longitud de los registros analizados. En el Capítulo 4 se estudia la precisión de los mecanismos de “lectura” endógenos que involucran la ligadura de moléculas “efectoras” a sitios en la célula y la posterior generación de una respuesta que depende de la concentración “leída”. Se presentan, en particular, expresiones que permiten estimar el error en la concentración sensada como función del tiempo de observación y los tiempos característicos del sistema. Uno de los mayores aportes de esta parte del trabajo radica en que, a diferencia de estudios anteriores, las expresiones describen el decaimiento del error para todo el rango de tiempos de observación, no sólo en el límite asintótico. Por otro lado, incorpora una correción que tiene en cuenta la no linealidad del sistema que es relevante para tiempos tempranos cuando se estudia el comportamiento de sitios de ligadura únicos. En el trabajo se muestra cómo esta corrección “no lineal” permite interpretar la reducción en las fluctuaciones observada en experimentos realizados en embriones de la mosca Drosophila melanogaster cuando se comparan las asociadas a la producción instantánea de mRNA con las de la proteína correspondiente acumulada a lo largo del tiempo. A partir de la descripción de las fluctuaciones tempranas se presenta también en este Capítulo una estimación de la distribución de tiempos de espera entre eventos de ligadura consecutivos. La distribución obtenida permite interpretar observaciones experimentales de la actividad de enzimas a nivel de molécula única sin recurrir a modelos que suponen que la molécula fluctúa entre un sinnúmero de estados conformacionales distintos. La observación de fenómenos in vivo mediante microscopía de fluorescencia es en gran parte factible debido a que pueden manipularse los organismos en estudio para que expresen algunas proteínas de interés con una cola fluorescente. Esto permite, por ejemplo, estudiar las propiedades espacio-temporales de gradientes de proteínas involucrados en morfogénesis. Un caso analizado con gran detalle es el del desarrollo embrionaria temprano de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, en particular, el del gradiente de la proteína Bicoid (Bcd) a lo largo del eje antero-posterior. En muchos trabajos se interpretan las observaciones experimentales en el marco de un modelo (SDD) en el que el Bcd es sintetizado en un extremo del embrión desde donde difunde a lo largo de éste a la vez que se degrada. El modelo SDD no logra explicar cuantitativamente las características observadas del gradiente. En el Capítulo 5 se analiza de qué modo varía la información que puede extraerse de las imágenes al tener en cuenta que Bcd no sólo difunde sino que también se liga a sitios internos y que la fluorescencia observada no distingue entre Bcd libre y Bcd ligado. Se introduce para tal fin una extensión del modelo SDD al que llamamos SDID ya que incluye la interacción con sitios de ligadura con el que se estudia tanto la dinámica espacio-temporal de la concentración de Bcd como su habilidad para actuar como factor de transcripción. El modelo logra reproducir las observaciones experimentales con parámetros biofísicos razonables y abre la puerta a una reinterpretación de la relación existente entre Bcd y la proteína Hunchback para cuya producción el Bcd es factor de transcripción. Finalmente, en el Capítulo 6 se analiza la validez y limitaciones de un modelo que describe las fluctuaciones de fluorescencia en imágenes donde se observa la distribución de Ca2+ intracelular utilizando fluoróforos que cambian su intensidad al ligar a este ión (single-wavelength Ca2+ dyes). El modelo es la base de un método que permite comparar cuantitativamente entre sí experimentos de señales de Ca2+ realizados en distintas condiciones experimentales y que ayuda, por otro lado, a identificar parámetros experimentales óptimos para cada “set-up”. El análisis detallado presentado en este Capítulo muestra que el modelo reproduce correctamente las fluctuaciones observadas aunque no siempre para un conjunto unívoco de parámetros. Palabras claves: Modelado de técnicas ópticas, análisis fluctuaciones, sistemas de reacción-difusión, fluorescencia, correlación

Abstract:
In this Thesis we study, from a theoretical point of view, different optical techniques that allow the observation in vivo of processes that occur in cells and embryos. In all the techniques that we explore, fluorescence records or images are obtained. One of the aims of the work is to determine how to analyze the experimental data so as to extract quantitative information about biophysical parameters that are relevant for the observed processes. In particular, we analyze how to do it when the observed molecules diffuse and interact (react) with other species. In the various cases that we analyze, fluctuations play a key role since they are used to extract information. Based on the knowledge obtained through the study of fluctuations in fluorescence microscopy experiments in this Thesis we also advance on another aspect that is relevant within the realm of biological signaling such as the time it takes for a cellular endogenous mechanism to “sense” the concentration of a ligand with a certain accuracy level. In the first part of the Thesis we focus on the study of the technique known as Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). In FCS experiments one obtains records of the fluorescence coming from a small volume from which one computes the autocorrelation function (AFC) of the fluorescence fluctuations. Fitting the ACF it is possible to determine the correlation times and the weights with which they enter the ACF. Using a dynamical model of the processes that underlie the observations it is possible to go from the fitting to biophysical parameters. In particular, the transport rate of the marked molecules can be determined from the correlation times and their concentrations from the weights. In Chapter 2 we study how the correlation times depend on the parameters of the system and of the experiment in a case in which the marked molecules diffuse and react. In particular, we show that the correlation times change from being determined exclusively by the free diffusion coefficients of the species involved to depend on the reaction rates. In Chapter 3 we study how the ACF varies depending on whether the marked molecules interact with mobile or immobile sites. We find that, when the sites are immobile, there is one correlation time whose weight becomes exactly equal to zero. This finite change has implications on how to estimate concentrations from the ACF. In this Chapter we also study what is the accuracy with which concentrations can derived from the experiments depending on the length of the analyzed records. In Chapter 4 we study the precision of the endogenous “reading” mechanisms that involve the binding of effectors to sites on the cell that subsequently induce an end response that depends on the “read” concentration. We present, more specifically, expressions that allow us to estimate the error in the sensed concentration as a function of the observation and characteristic times of the system. One the main contributions of this part of the work is that, differently from previous studies, our expressions describe the decay of the error for all observation times, not just the asymptotic behavior. On the other hand, we incorporate a correction that takes into account the nonlinearity of the system which is relevant for the early behavior of single binding sites. We show in the Thesis how this “nonlinear” correction allows us to interpret the reduction in the fluctuation size observed in experiments performed in the fly Drosophila melanogaster when comparing those associated to the instantaneous production of mRNA with those of the accumulated corresponding protein. Having an expression that describes the behavior of the early fluctuations allows us to obtain an approximation of the waiting time distribution between consecutive bindings of a single binding site. This approximated distribution allows us to interpret experimental observations on the activity of enzymes at the single molecule level without the need of assuming that the molecule fluctuates among innumerous different conformers. The observation of processes in vivo by means of fluorescence microscopy is doable to a great extent because it is possible to manipulate organisms and cells so that the proteins of interest are expressed with a fluorescent tag. This allows the direct study of the spatio-temporal properties of gradients of proteins involved in morphogenesis. A case that has been analyzed with great detail is that of the early embryonic development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, particularly, of the gradient of the Bicoid (Bcd) protein along the antero-posterior axis. In several studies the experimental observations of this gradient is interpreted within the SDD model in which Bcd is synthesized at one end of the embryo from which it diffuses while it is degraded. The SDD model cannot explain quantitatively all the observed characteristics of the gradient. In Chapter 5 we analyze in which ways the information that can be extracted from the images changes if we take into account that Bcd not only diffuses but binds to sites on its way as well. To this end we introduce an extension of the SDD model which we call SDID because it includes the interaction with binding sites with which we study the spatio-temporal dynamics of the concentration of Bcd as well as its ability to act as transcription factor. The model reproduces the observations with realistic parameter values and opens up the possibility of re-interpreting the relationship between Bcd and the protein, Hunchback, for which production Bcd is a transcription factor. Finally, in Chapter 6 we analyze the validity and limitations of a model that describes the fluorescence fluctuations of Ca2+ images obtained using dyes that change their intensity of emission upon Ca2+ binding (single-wavelength Ca2+ dyes). The model is the basis of a method that allows the quantitative comparison of Ca2+ imaging experiments performed under different conditions and which helps with the choice of experimental parameters for each set-up. The detailed analysis presented en this Chapter shows that the model reproduces correctly the observed fluctuations albeit not always for a unique set of parameter values. keywords: Modeling of Optical Techniques, Fluctuation Analysis, Reaction-diffusion Systems, fluorescence, correlation

* A este resumen le pueden faltar caracteres especiales. Consulte la versión completa en el documento en formato PDF

Registro:
Título : Análisis y modelado de experimentos de fluorescencia. Aplicación a señales de calcio     =    Analysis and modeling of fluorescence experiments. Application to calcium signals
Autor : Pérez Ipiña, Emiliano
Director : Ponce Dawson, Silvina
Consejero : Ferraro, Marta
Jurados : Chara, Osvaldo  ; Diambra, Luis  ; Morelli, Luis
Año : 2015-10-22
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Física
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Físicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5847_PerezIpina
Idioma : Español
Area Temática : Física / Biofísica
Palabras claves : MODELADO DE TECNICAS OPTICAS; ANALISIS FLUCTUACIONES; SISTEMAS DE REACCION-DIFUSION; FLUORESCENCIA; CORRELACION; MODELING OF OPTICAL TECHNIQUES; FLUCTUATION ANALYSIS; REACTION-DIFFUSION SYSTEMS; FLUORESCENCE; CORRELATION
URL al Documento : 
URL al Registro : 
hola chau _gs.DocumentHeader_ chau2 _documentheader_ chau3
Estadísticas:
     http://digital.bl.fcen.uba.ar
Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria - Pabellón II - C1428EGA - Tel. (54 11) 4789-9293 int 34