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Ver el documento (formato PDF)   Bustamante, Juan Pablo.  "Estudio fisicoquímico y bioinformático de la familia de hemoglobinas truncadas"  (2015-11-13)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Las hemoproteínas son proteínas que poseen un grupo hemo unido generalmente de forma covalente. Participan en transporte de gases, en reacciones de transferencia de electrones y catálisis de reacciones redox. Un grupo muy particular dentro de estas proteínas son las hemoglobinas truncadas (trHbs), que constituyen una familia interesante de referencia para estudios de estructura y función de proteínas, debido a su plegado conservado y pequeño tamaño. Las trHbs están presentes en los tres super reinos de la vida, bacteria, arquea y varios organismos eucariotas. Han sido clasificadas en tres grupos, conocidos como N, O y P. Si bien la mayoría de trHbs no poseen una función asignada, se conoce que ésta generalmente depende de su afinidad por ligandos pequeños, es decir, de la relación entre la velocidad a la cual captan y liberan ligandos, caracterizadas por constantes de velocidad kon y koff, respectivamente. De allí la relevancia de abocarse al estudio de los determinantes moleculares de tal afinidad. Los procesos de captación y liberación de ligandos han sido extensamente estudiados durante los últimos años por diferentes grupos de investigación, incluido el grupo donde se desarrolló la presente tesis, utilizando enfoques teóricos y experimentales. Sin embargo, solo se estudiaron algunos de los procesos involucrados, tales como el rol de túneles e interacciones de puentes de hidrógeno, encontrándose únicamente tendencias cualitativas respecto a constantes kon y koff. En la presente tesis, a través de la aplicación de diversas técnicas computacionales, se profundizó en la descripción anterior mediante la inclusión de dos determinantes moleculares cruciales en el proceso de captación de ligandos: las cavidades internas de las proteínas y el rol de las moléculas de agua presentes en el sitio activo. Adicionalmente, se construyó un modelo matemático, validado a través de un riguroso análisis estadístico, que permite predecir de manera cuantitativa las constantes kon y koff de O2. Dado que la mayoría de trHbs no poseen una función asignada, se extendió el alcance del modelo propuesto a toda la familia de trHbs, prediciendo valores para una gran cantidad de trHbs (sobre un total de ~1100 secuencias proteicas). Se asignaron posibles funciones moleculares y se analizó a esta familia de proteínas en un contexto evolutivo-funcional, caracterizando a cada grupo filogenético. De manera adicional, el estudio evolutivo reveló que hay un grupo de trHbs que comparte características comunes que lo diferencian significativamente del resto de los grupos conocidos (N, O y P), por lo que se lo clasificó como un cuarto grupo, denominado Q. Finalmente, puesto que una de las proteínas más estudiadas durante el desarrollo de la presente tesis (la trHb O de Thermobifida fusca, Tf-trHbO) es una proteína termoestable perteneciente a una actinobacteria termófila, se estudiaron las bases moleculares de su termoestabilidad comparándola con una trHb mesoestable: la trHb O de Mycobacterium tuberculosis. Se encontró que la alta estabilidad térmica de la Tf-trHbO se explica, en gran parte, por el cambio de un único aminoácido que altera la estructura de un loop, haciéndolo más flexible y promoviendo la formación de puentes salinos. En su conjunto, esta tesis presenta una profunda caracterización de dos factores cruciales en el proceso de captación de ligandos en hemoglobinas truncadas, que, incluidos en un modelo matemático junto a una descripción del proceso de liberación de ligandos como ha sido previamente descripta, permiten explicar valores experimentales de kon y koff de O2 con una precisión muy alta. La extensión del modelo a toda la familia de trHbs ha permitido asignar posibles funciones moleculares a una gran cantidad de miembros de estas globinas. Complementado con un análisis evolutivo y bioinformático, se ha logrado además obtener una detallada caracterización de cada grupo de trHbs, descubriendo incluso un grupo nuevo. Por último, el estudio teórico sobre la termoestabilidad de la Tf-trHbO abre las puertas a posteriores estudios que analicen las bases moleculares de la adaptación a condiciones extremas. Palabras clave: hemoglobinas truncadas, cavidades internas, sitios de hidratación, dinámica molecular, QM/MM, predicción de constantes cinéticas, predicción secuencia-estructura-función, filogenia, evolución molecular, bioinformática, termoestabilidad.

Abstract:
Hemeproteins are proteins that possess a heme group generally covalently bound. They participate in gas transport, electron transfer reactions and catalysis of redox reactions. A particular group within these proteins is the truncated hemoglobins (trHbs), which constitute an interesting benchmark group for structure-to-function studies, due to its conserved fold and small size. The trHbs are present in all three superkingdoms of life, bacteria, archeas and several eukaryotes. They have been classified into three groups, labeled as N, O and P. While most trHbs do not have an assigned function, it is well known that generally their function depends on their affinity for small ligands, i.e. the balance between capture and release ligand rates, characterized by the kon and koff rate constants, respectively. Hence, the importance of focusing on the study of the molecular determinants of this affinity. The ligand capture and release processes have been extensively studied throughout in the last several years, by different research groups, including the group in which this thesis has been developed, with theoretical and experimental approaches. However only some involved processes, such as the role of tunnels and hydrogen bond interactions, were studied finding merely qualitative trends in kon y koff rate constants. In the present thesis, through the application of a variety of computational techniques, we incorporated to the previous description two key determinant factors of the ligand capture process: protein internal cavities and the role of water molecules in the active site. Additionally, validated through a rigorous statistical analysis, a mathematical model for the quantitative prediction of O2 kon y koff rate constants was built. Due to the fact that most trHbs do not have an assigned function, we extended our proposed model to the whole family, predicting values for a large amount of trHbs (over ~1100 protein sequences). In this context, possible molecular functions were assigned, as well as a protein family analysis in an evolutionary-functional scenario, characterizing each phylogenetic group. Furthermore, the evolutionary study revealed a novel trHb group that shares common features that differentiate it from the rest known groups (N, O and P), so it was classified in a fourth group, labeled as Q. Finally, given that one of the most studied proteins along this thesis (the trHb O from Thermobifida fusca, Tf-trHbO) is a thermostable protein from a thermophilic actinobacteria, the molecular basis of its thermostability was studied, comparing it with a mesostable trHb: the trHb O from Mycobacterium tuberculosis. It has been found that the high thermal stability of TftrHbO, is mainly explained by a single amino acid change that alters a loop structure making it more flexible, which also promotes the formation of salt bridges. Overall, in this thesis we present for the truncated hemoglobin family a deep characterization of two key determinant factors of the ligand capture process that, included in a mathematical model together with a description of the ligand release process that has been previously made, allows us to explain experimental O2 kon y koff values with high precision. The extension of the model to the whole trHb family enabled putative molecular function assignments. Complemented by an evolutionary and bioinformatics analysis, a detailed characterization of each trHb group was also achieved, describing a novel group. Last but not least, the theoretical study of the Tf-trHbO thermostability is a first step towards further indepth studies of the molecular basis of adaptation to extreme conditions. Keywords: truncated hemoglobins, internal cavities, hydration sites, molecular dynamics, QM/MM, kinetic constants prediction, sequence-structure-function prediction, phylogeny, molecular evolution, bioinformatics, thermostability.

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Registro:
Título : Estudio fisicoquímico y bioinformático de la familia de hemoglobinas truncadas     =    Physicochemical and bioinformatic study of the truncated hemoglobin family
Autor : Bustamante, Juan Pablo
Director : Estrin, Darío A.
Director Asistente : Boechi, Leonardo
Consejero : Martí, Marcelo
Jurados : Fernández Alberti, Sebastián  ; González-Lebrero, Rodolfo M.  ; Parisi, Gustavo D.
Año : 2015-11-13
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5848_Bustamante
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Computacional
Química / Fisicoquímica
Palabras claves : HEMOGLOBINAS TRUNCADAS; CAVIDADES INTERNAS; SITIOS DE HIDRATACION; DINAMICA MOLECULAR; QM/MM; PREDICCION DE CONSTANTES CINETICAS; PREDICCION SECUENCIA-ESTRUCTURA-FUNCION; FILOGENIA; EVOLUCION MOLECULAR; BIOINFORMATICA; TERMOESTABILIDAD; TRUNCATED HEMOGLOBINS; INTERNAL CAVITIES; HYDRATION SITES; MOLECULAR DYNAMICS; QM/MM; KINETIC CONSTANTS PREDICTION; SEQUENCE-STRUCTURE-FUNCTION PREDICTION; PHYLOGENY; MOLECULAR EVOLUTION; BIOINFORMATICS; THERMOSTABILITY
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