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Ver el documento (formato PDF)   de Paola, María Matilde.  "Caracterización molecular de las proteínas SNSP y NSF en ovocito de ratón: su rol en la exocitosis de gránulos corticales e implicancias en la fertilidad"  (2016-03-10)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La exocitosis de gránulos corticales (EGC) es un tipo de secreción regulada por Calcio que involucra un proceso de fusión de membranas esencial para la fecundación. Luego de la fusión del espermatozoide, los gránulos corticales son exocitados y liberan su contenido al espacio perivitelino. Esta secreción difunde hacia la zona pelúcida, y la transforma en una barrera física, evitando así la poliespermia, y asegurando un desarrollo embrionario normal. El mecanismo molecular que media la fusión de membranas durante la EGC se encuentra escasamente caracterizado y se cree que es mediado por la vía de las SNARE (SNAP receptors). El objetivo principal de este trabajo fue investigar si las SNAP (soluble NSF attachment proteins) y NSF (N-ethilmaleimide sensitive factor), proteínas clave en la vía de las SNARE, median la EGC en ovocito. El análisis de la expresión génica mostró que α SNAP, γ SNAP y NSF se expresan en ovocitos de ratón. Ensayos de Western blot mostraron que la expresión de estas proteínas se mantiene en niveles similares durante la maduración y activación temprana del ovocito. Su localización fue observada principalmente en la región cortical, enriquecida en GC. Para evaluar la función de estas proteínas en la EGC, se perturbó a las SNAP y NSF endógenas previo a la activación de ovocitos en metafase II. La microinyección de α SNAP salvaje y de la mutante dominante negativa L294A de α SNAP inhibió la EGC estimulada por Estroncio. NEM, un inhibidor irreversible de NSF y la microinyección de la mutante dominante negativa D1EQ de NSF inhibieron la EGC. La microinyección de los anticuerpos anti-α SNAP y anti-NSF fueron capaces de inhibir la EGC. Para comprender el rol de α SNAP en la fertilidad femenina, utilizamos la cepa de ratones hyh (hydrocephalus with hop gait), portadora de una mutación puntual (M105I) en el gen de α SNAP. Debido a que el ratón knockout para α SNAP es letal embrionario, los ratones hyh proveen un modelo único para el estudio de su función in vivo. Los resultados obtenidos indicaron que las hembras hyh presentan una severa reducción en su fertilidad debido a una combinación de defectos producidos por la proteína mutada. Nuestros resultados revelan que α SNAP, γ SNAP y NSF son expresados en ovocitos de ratón, que α SNAP y NSF son requeridos para la EGC y que la mutación M105I en α SNAP conduce a defectos multifactoriales en la fertilidad de las hembras hyh. Estos datos demuestran por primera vez que α SNAP y NSF juegan un rol importante en la reproducción femenina.

Abstract:
Cortical granule exocytosis (CGE) is a calcium-regulated secretion that represents a membrane fusion process essential for fertilization. Following sperm fusion, cortical granules (CG) undergo exocytosis to release their content into the perivitelline space. The secretion diffuses into the zona pellucida and transforms it into a physical barrier, avoiding polyspermy and ensuring normal embryonic development. The molecular mechanism of membrane fusion during CGE is still poorly understood and is thought to be mediated by the SNARE (SNAP receptors) pathway. The main purpose of the present study was to investigate if SNAP (soluble NSF attachment proteins) and NSF (N-ethilmaleimide sensitive factor), two key proteins in the SNARE pathway, mediate CGE in an oocyte model. We first investigated the gene expression of SNAP and NSF. RT-PCR results showed that α and γ SNAP (but not β), and NSF are expressed in mouse oocytes. Immunoblotting analysis showed that the expression of these proteins maintains a similar level during oocyte maturation and early activation. Their localization was mainly observed at the cortical region, which is enriched in CGs. To evaluate the function of these proteins in CGE, endogenous SNAP and NSF proteins were perturbed prior to CGE activation in metaphase II oocytes. The microinjection of wild type α SNAP and L294A mutant of α SNAP inhibited CGE stimulated by strontium. NEM, an irreversibly inhibitor of NSF, and the microinjection of the dominant negative mutant D1EQ NSF inhibited CGE. The microinjection of anti-α SNAP and anti-NSF antibodies was able to abolish CGE. Furthermore, in an attempt to further understand the role of α SNAP in female fertility, we used a spontaneous mutant mouse model for α SNAP known as hyh (hydrocephalus with hop gait), carrying a point mutation M105I. Due to α SNAP knockout mice is embryonic lethal, the hyh mice provide a unique in vivo model for in-depth research of α SNAP function. We have demonstrated that hyh female mice exhibit strongly reduced fertility parameters. Our findings revealed that α SNAP, γ SNAP, and NSF are expressed in mouse oocytes, that α SNAP and NSF are required for CGE and that M105I mutation in α SNAP leads to multifactorial fertility defects in hyh female mice. These data demonstrate for the first time that α SNAP and NSF play an important role in female reproduction.

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Registro:
Título : Caracterización molecular de las proteínas SNSP y NSF en ovocito de ratón: su rol en la exocitosis de gránulos corticales e implicancias en la fertilidad     =    Molecular characterization of SNAP and NSF proteins in mouse oocyte: their role in cortical granules exocytosis and fertility implications
Autor : de Paola, María Matilde
Director : Michaut, Marcela A.
Consejero : Paz, Dante
Jurados : Marengo, Fernando D.  ; Calvo, Juan Carlos  ; Cohen, Débora Juana
Año : 2016-03-10
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad Nacional de Cuyo. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. M. Burgos. Laboratorio de Biología Reproductiva
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5911_DePaola
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Reproducción
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