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Ver el documento (formato PDF)   Davies Sala, Carol G..  "Desarrollo de nuevas estrategias antimicrobianas: silenciamiento de genes bacterianos mediante tecnología antisentido"  (2016-03-28)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La emergencia de enfermedades infecciosas causadas por bacterias multiresistentes y la falta de antibióticos para su tratamiento constituyen una amenaza para la salud global. Ante la necesidad de desarrollo de nuevos antimicrobianos se ha considerado la posibilidad de emplear técnicas de silenciamiento génico mediado por ARNs antisentido. Una de estas estrategias de silenciamiento es la denominada tecnología EGS, que se encuentra mediada por la Ribozima P o ARNasa P, una ribozima presente en todos los dominios y que en bacterias Gram negativas está conformada por una subunidad ARN-catalítica y por otra proteica. La ARNasa P participa en la maduración de los ARN de transferencia generando el extremo 5´ maduro por un corte simple endonucleolítico de su precursor. Esta propiedad puede emplearse para mediar el corte de una molécula de ARN blanco - cuya expresión quiera ser silenciada- en presencia de un oligorribonucleótido complementario, conocido como External Guide Sequence (EGS). Una vez formado el dúplex ARN blanco : EGS, este complejo puede ser reconocido por la ARNasa P como sustrato y entonces promover el corte endonucleolítico del ARN blanco, inactivándolo. El objetivo global en el que se enmarca este trabajo de tesis consiste en evaluar estrategias de silenciamiento génico mediante tecnología antisentido como posibles antimicrobianos o para prolongar el uso de los antibióticos ya existentes. En este trabajo de tesis doctoral se exploró la posibilidad de inhibir la expresión de genes bacterianos a través del uso de tecnología EGS antisentido. Inicialmente se trabajó con cepas de Escherichia coli y como blanco se eligió al ARN mensajero del gen ftsZ cuyo producto, la proteína FtsZ es un análogo bacteriano de la tubulina y esencial para la división celular. Tanto la expresión de estos pequeños ARNs antisentido dirigidos contra el mensajero ftsZ como la administración exógena de análogos de ácidos nucleicos no hidrolizables por nucleasas bacterianas, generaron una inhibición de la división celular, originando un cambio en la morfología de las bacterias y una disminución de la viabilidad de las células tratadas. Estos resultados apoyan la idea que los EGSs dirigidos contra genes vitales bacterianos podrían considerarse como potenciales antimicrobianos. Con la intención de explorar la aplicación de esta tecnología de silenciamiento génico a una especie bacteriana de importancia clínica creciente, se logró identificar, clonar, transcribir y purificar los componentes de la ribozima P de Acinetobacter baumannii. Posteriormente, la ribozima se reconstituyó in vitro, presentando actividad tanto en presencia de un sustrato natural (pre-ARNtTyr) como de un sustrato bimolecular compuesto por una dupla ARNm-EGS. De esta manera, se generó un sistema de evaluación in vitro de EGSs candidatos para Acinetobacter baumannii, paso previo a la realización de ensayos in vivo sobre esta especie bacteriana.

Abstract:
The emergence of infectious diseases caused by multi-resistant bacteria and the lack of traditional antibiotics for its treatment are a concerning threat for global health. Facing the need for development of new antimicrobials, gene silencing through antisense RNAs have been considered as a viable solution. One of these antisense strategies is called EGS technology which is mediated by ribozyme P or RNase P, a ribozyme present in all domains of life that in Gram negative bacteria is composed of two subunits: one catalytic – RNA and another peptidic. The RNase P processes pre-transfer RNA, maturating the 5´end by a simple endonucleolitic cut of its precursor. This property can be used to cut any other target RNA molecule in the presence of a complementary oligoribonucleotide, known as External Guide Sequence (EGS). Once the duplex target-RNA: EGS is formed can be recognized by the ribozyme P as a substrate and hence cut the RNA target, leading to its inactivation. The general purpose in which this thesis work is immersed consists on the evaluation of different gene silencing strategies through antisense technology and their use as possible antimicrobial agents or to extend the usage of already existent antibiotics. In this thesis work the possibility of inhibiting bacterial gene expression through EGS antisense technology was explored. Initially, strains of Escherichia coli were employed and ftsZ mRNA was selected as target. FtsZ protein is a bacterial tubulin analogue essential for cell division. Expression of RNA-EGSs targeting ftsZ mRNA as well as exogenous administration of EGSs composed of nucleic acid analogues non hydrolysable by bacterial nucleases, led to a change in bacterial morphology and a decrease in cell viability, elicited by an impaired cell division. These results support the idea that EGSs targeting bacterial vital genes could be considered as potential antimicrobial agents. Pursuing the intention to apply this gene silencing technology to a bacterial species with growing clinical importance, the components of the ribozyme P from Acinetobacter baumannii were identified, cloned, transcribed and purified. Then, the RNase was reconstituted in vitro, showing activity in the presence of a natural substrate such as pre-tRNATyr and also with a bimolecular substrate conformed by mRNA and EGS. Thereby an in vitro evaluation system was generated in order to select candidate EGSs for Acinetobacter baumannii, previous procedure to in vivo assays.

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Registro:
Título : Desarrollo de nuevas estrategias antimicrobianas: silenciamiento de genes bacterianos mediante tecnología antisentido     =    Development of new antimicrobial strategies: bacterial gene silencing through antisense technology
Autor : Davies Sala, Carol G.
Director : Zorreguieta, Angeles
Consejero : Zorreguieta, Angeles
Jurados : Centrón, Daniela  ; Valverde, Claudio Fabián  ; Lepek, Viviana Claudia
Año : 2016-03-28
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica
Fundación Instituto Leloir
Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires (IIBBA)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5940_DaviesSala
Idioma : Español
Area Temática : 
Palabras claves : RIBOZIMA P; ANTIMICROBIANOS; SILENCIAMIENTO GENICO; TECNOLOGIA ANTISENTIDO; FTSZ; ACINETOBACTER BAUMANNII; RIBOZYME P; ANTIMICROBIAL; GENE SILENCING; ANTISENSE TECHNOLOGY; GRAM NEGATIVE; FTSZ; ACINETOBACTER BAUMANNII
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