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Ver el documento (formato PDF)   Sahores, Ana.  "Rol de la vía FGF2/FGFR en la resistencia a la terapia hormonal en cáncer de mama"  (2016-03-17)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El 75% de los carcinomas mamarios expresan receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP) y son susceptibles a una terapia endocrina. Sin embargo, con el tiempo, algunos pacientes desarrollan resistencia (resistencia hormonal adquirida) y otros no responden al tratamiento desde el comienzo (resistencia constitutiva). En nuestro laboratorio, utilizando modelos de carcinomas mamarios murinos y humanos, hemos demostrado que los tumores respondedores a la terapia con el antiprogestágeno mifepristona (MFP) tienen mayor expresión de la isoforma A del RP (RPA) que de la isoforma B (RPB). A su vez, los tumores con resistencia constitutiva o adquirida, se caracterizan por manifestar la relación inversa (RPB>RPA). Se han propuesto diversas hipótesis para explicar los mecanismos que conducen a la resistencia endócrina, entre ellas, la activación constitutiva de vías de transducción de señales. La vía que involucra al FGF2 y sus receptores está constituida por cuatro receptores (FGFR1-4) y cinco isoformas de FGF2 con distinto peso molecular: la isoforma de 18 kDa o LMW-FGF2 y las de alto peso o HMW-FGF2 de 22; 22,5; 24 y 34 kDa. En trabajos previos demostramos que, en muestras de carcinomas mamarios humanos, existe una asociación significativa entre la expresión de FGFR2 y REα; también observamos una correlación positiva entre la expresión de FGFR1 y un alto grado histológico. Demostramos también que, en tumores sensibles a la terapia endocrina, el FGFR2 activado por el FGF2 estromal participa en el crecimiento tumoral a través de la activación de los RP. Si bien se ha demostrado que la vía del FGF2/FGFR se encuentra desregulada en numerosas neoplasias y patologías del desarrollo, en muestras de pacientes con cáncer de mama aún es controvertida la asociación entre la expresión de FGF2 y el pronóstico de la enfermedad. En base a estos antecedentes, nuestra hipótesis de trabajo es que durante la adquisición de la resistencia endocrina se produce un cambio en la expresión y señalización de FGF2 que favorece el crecimiento y la progresión tumoral. Nuestro objetivo general fue evaluar el rol de la vía FGF2/FGFR en el crecimiento y la progresión del cáncer de mama. En primer lugar, utilizamos el modelo murino de carcinomas mamarios generados en nuestro laboratorio. Observamos, tanto por inmunohistoquímica como por Western blot, que las variantes resistentes de tres familias tumorales diferentes (C4, 59 y C7) expresan mayores niveles de FGFR1 y FGF2 que los tumores sensibles. Por inmunohistoquímica, observamos que el FGF2 se localiza predominantemente en el epitelio o en el estroma tumoral de las variantes resistentes y sensibles, respectivamente. Es interesante observar que, el análisis de la expresión de las distintas isoformas de FGF2 reveló que las variantes resistentes expresan mayores niveles de las isoformas HMW-FGF2 que las variantes sensibles. Asimismo, mediante ensayos de ELISA mostramos que, en los tumores resistentes adquiridos y constitutivos, la localización es mayormente intracelular y extracelular, respectivamente. Luego, evaluamos la funcionalidad de la vía de FGF2/FGFR en cultivos primarios de células epiteliales de las tres familias tumorales. Observamos que el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular de tumores sensibles y resistentes constitutivos, pero no afecta la proliferación celular de los tumores resistentes adquiridos de la familia C4. Por otra parte, el tratamiento con dos inhibidores distintos de FGFR, PD 173074 y BGJ398, inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres familias tumorales, lo que indica un rol proliferativo de esta vía. Sin embargo, al realizar ensayos in vivo con el inhibidor BGJ398, éste sólo reduce parcialmente el crecimiento tumoral de las variantes C4-HI (sensible) y C7-HI (resistente constitutiva). El inhibidor no tuvo efectos significativos sobre el crecimiento tumoral de las variantes resistentes de la familia C4, aunque indujo signos de regresión tumoral temprana en todas las variantes tumorales ensayadas (C4-HI, C4-2-HI, C4-HIR, 59-HI, C7-HI). Las diferencias en el alcance de los efectos observados en cultivo e in vivo sugieren que deben desarrollarse inhibidores con mayor eficacia in vivo. En conjunto, los resultados obtenidos con el modelo murino muestran una correlación positiva entre la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 con la resistencia hormonal y sugieren que, en la progresión tumoral, habría un aumento en la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 en el epitelio tumoral. Este aumento conduce a un cambio de una señalización paracrina en las variantes sensibles, a una autocrina o intracrina en los tumores resistentes constitutivos o adquiridos, respectivamente. A continuación, validamos los resultados en un modelo de cáncer de mama humano, para lo cual utilizamos la línea celular T47D-WT y sus variantes: la línea T47D-YA, con alta expresión de RPA y sensible a MFP, y la línea T47D-YB, con alta expresión de RPB y resistente a MFP. Por inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y Western blot, observamos que la línea T47D-YB expresa mayores niveles de FGFR1, FGFR2 y HMW-FGF2 respecto de la línea T47DYA. Por otro lado, el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular en las líneas T47D-WT e -YA pero no altera su proliferación en las células T47D-YB. La línea resistente presenta mayor actividad basal de la vía de FGF2/FGFR, ejemplificada en la fosforilación de FRS2 y activación predominantemente de la vía de AKT, en comparación con la línea sensible. El LMW-FGF2 modularía principalmente la activación de las vías mencionadas en las líneas T47D-WT e -YA, lo que sugiere una activación constitutiva en la línea resistente. El BGJ398 inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres líneas celulares, indicando que la vía de FGF2/FGFR cumple un rol proliferativo. Finalmente, generamos variantes de la línea T47D-YA que sobreexpresan las isoformas de 18 y 22,5 kDa de FGF2 y evaluamos su efecto sobre la sensibilidad a MFP, TLP y TAM. En ensayos de recuento celular observamos que la sobreexpresión de las isoformas de 18 y 22,5 kDa promovió un aumento en la tasa de proliferación celular y resistencia al tratamiento endocrino en comparación con la línea T47D-YA infectada con el plásmido vacío (T47D-YA-Vac). La resistencia a MFP se mantuvo aún en ensayos in vivo y se observaron signos de malignidad en los tumores primarios, particularmente en la línea T47D-YA-22,5. Esto se evidenció en la capacidad para invadir tejidos adyacentes al tumor, como piel, músculo y tejido adiposo. Si bien algunos de los animales portadores de tumores T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa focos metastásicos en los pulmones, 100% de los ratones con T47D-YA-22,5 presentaron metástasis pulmonares y un mayor número de focos con respecto a T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa. Nuestras observaciones indican que el FGF2 promueve el crecimiento tumoral en ambas variantes, sensibles y resistentes. Sin embargo, los resultados sugieren que, en los tumores sensibles, el estroma proveería el FGF2 que induciría el crecimiento tumoral a través de sus receptores de membrana y el RP de forma paracrina. Por otro lado, en los tumores resistentes, el propio parénquima tumoral expresaría elevados niveles de FGF2 (particularmente LMW-FGF2) y que, a través de un loop autocrino que involucra al FGFR1, gatillaría señales de proliferación, independientemente de la presencia de progestágenos o antiprogestágenos. No descartamos que exista también un loop intracrino, donde el FGF2 intracelular, particularmente las HMW-FGF2, serían responsables de la proliferación celular, resistencia a endocrina y diseminación metastásica. Nuestros estudios contribuyen a esclarecer el rol de las isoformas de FGF2 en la progresión tumoral mamaria y representan la primera evidencia de resistencia hormonal vinculada a HMW-FGF2.

Abstract:
Two-thirds of breast cancers express estrogen and progesterone receptors (ER and PR, respectively) and are standard targets for endocrine therapy. Most tumors initially respond to endocrine therapy, but many will eventually develop resistance (acquired hormone resistance) while others will fail to respond from the beginning (constitutive hormonal resistance) despite expressing hormone receptors. In our lab, using murine and human mammary carcinomas, we have demonstrated that tumors which respond to antiprogestin therapy (mifepristone; MFP) express higher levels of the isoform A of PR (PRA) than the isoform B (PRB), whereas tumors with constitutive or acquired hormonal resistance have the inverse ratio (PRB>PRA). Many hypothesis have been proposed to explain the mechanisms that lead to endocrine resistance, among them, the constitutive activation of proliferative pathways. In humans, the FGF2/FGFR pathway is formed by four receptors (FGFR1-4) and five FGF2 isoforms with different molecular weight: low molecular weight isoform or LMW-FGF2 of 18 kDa and high molecular weight isoform or HMW-FGF2 of 22; 22,5; 24 and 34 kDa. In previous experiments and using human breast cancer samples, we found a significant association between the expression of FGFR2 and ERα, and reported a positive correlation between the expression of FGFR1 and a higher histological grade. We also demonstrated that stromal FGF2 activates FGFR2 and PR pathways, inducing tumor growth in hormone responsive carcinomas. It has been proved that the FGF2/FGFR pathway is dysregulated in numerous neoplasias and developmental pathologies. However, its association with breast cancer progression is still controversial. Taking into account these findings, our working hypothesis is that during tumor progression there is a switch in FGF2 expression and signaling that favors tumor growth and progression. Our main goal, therefore, was to study the role of the FGF2/FGFR pathway in breast tumor growth and progression. We used a murine model of mammary carcinomas developed in our laboratory. By immunohistochemistry and Western blot assays, we observed that all the resistant variants of three different tumor families (C4, 59 y C7) express higher FGFR1 and FGF2 levels than the responsive variants. By immunohistochemistry assays we observed that FGF2 labeling was predominantly localized in the epithelium and in the tumor stroma of the resistant and responsive variants, respectively. Analysis of the expression of the different FGF2 isoforms revealed that the resistant variants express higher levels of total FGF2, especially HMW-FGF2, compared to the responsive variants. We confirmed these findings using an ELISA assay and observed that acquired and constitutive resistant tumors differ in their FGF2 localization; whereas the former predominantly accumulate it within the cell, the latter also secrete it to the conditioned media. Next, we studied the activity of the FGF2/FGFR pathway in primary cultures of epithelial cells from three tumor families (C4, 59, and C7). Treatment with LMW-FGF2 induced cell proliferation in responsive and constitutive resistant tumors, though failed to affect cell proliferation of acquired resistant tumors of the C4 family. Furthermore, treatment with two different FGFR inhibitors, PD 173074 and BGJ398, significantly inhibited basal and FGF2- induced cell proliferation in the three tumor families, indicating a proliferative role of FGF2/FGFR pathway. In in vivo experiments, BGJ398 only inhibited tumor growth of C4-HI (responsive) and C7-HI (constitutive resistant) tumors. However, blocking the pathway induced early signs of regression in all evaluated variants (C4-HI, C4-2-HI, C4-HIR, 59-HI, and C7-HI). The observed differences in the in vitro and in vivo assays suggest that more efficient inhibitors should be developed. Altogether, these findings show a positive correlation between HMW-FGF2, FGFR1 expression, and hormone resistance. Moreover, during tumor progression there would be an increase in HMW-FGF2 and FGFR1 expression in the tumor epithelium, leading to a switch from a paracrine signaling in the responsive variants to an autocrine or intracrine loop in constitutive and acquired resistant tumors, respectively. Later, we validated the results in a human breast cancer model using the T47D-WT cell line and its variants: T47D-YA with high expression of PRA and responsive to MFP, and T47D-YB with high expression of PRB and resistant to MFP. By immunofluorescence, immunohistochemistry and Western blot, we observed that T47D-YB cells express higher levels of FGFR1, FGFR2, and HMW-FGF2 compared to the T47D-YA cells. By contrast, treatment with LMW-FGF2 induces cell proliferation only in T47D-WT and -YA cells and does not affect cell proliferation in the -YB line. The resistant variant presents higher basal activation of the FGF2/FGFR pathway, evidenced by phosphorylation of FRS2 and activation of the AKT pathway, compared to the responsive cell line. Consistent with the results obtained in the murine model, LMW-FGF2 regulates the activation of the mentioned pathways only in T47D-WT and -YA cells, suggesting a constitutive activation in the resistant cell line. Treatment with BGJ398 significantly inhibits basal and FGF2-induced cell proliferation in the three cell lines, indicating that the FGF2/FGFR pathway has a proliferative role in these cell lines. Finally, we generated T47D-YA cell line variants over-expressing the 18 and 22,5 kDa FGF2 isoforms, and studied their effect over MFP, TLP, and TAM sensibility. The over-expression of both isoforms increased cell proliferation and conferred resistance to endocrine therapy compared to the T47D-YA cell line infected with the control plasmid (T47D-YA-Vac). The MFP resistance was confirmed in in vivo assays and interestingly, we even observed malignant signs in the primary tumors, particularly in the YA-22,5 kDa cell line. These tumors were able to invade adjacent tissue, such as skin, muscle, and adipose tissue. Only some animals bearing -YA-Vac and -YA-18 kDa primary tumors registered lung metastasis, while 100% of the mice bearing -YA 22,5 kDa tumors presented lung metastasis and had more foci compared to YA-Vac and -YA-18 kDa. Our results suggest that FGF2 promotes tumor growth in both responsive and resistant tumor variants. However, we believe the underlying mechanisms are not the same, given that in responsive variants the stroma is the main producer of FGF2, which induces tumor growth through its membrane receptors and PR forming a paracrine loop. In resistant tumors, the parenchyma expresses high levels of FGF2 (mostly LMW-FGF2) that triggers proliferative and survival signals through an autocrine loop involving membrane FGFR1, regardless of the presence of progestins or antiprogestins. We still cannot rule out the existence of an intracrine loop, where the intracellular FGF2 (mostly HMW-FGF2) would be responsible for cell proliferation, resistance to antiprogestins, and metastatic dissemination. Altogether, these findings help to clarify the role of the FGF2 isoforms in breast tumor progression and are the first evidence of endocrine resistance associated to HMW-FGF2.

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Registro:
Título : Rol de la vía FGF2/FGFR en la resistencia a la terapia hormonal en cáncer de mama     =    Role of FGF/FGFR pathway in endocrine resistance in breast cancer
Autor : Sahores, Ana
Director : Lamb, Caroline A.
Consejero : Pecci, Adalí
Jurados : Simian, Marina  ; Vázquez, Elba S.  ; Sales, María Elena
Año : 2016-03-17
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica
Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME). Laboratorio de Carcinogénesis Hormonal
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5943_Sahores
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biología Molecular y Celular
Biología / Endocrinología
Palabras claves : CANCER DE MAMA; FGF2; FGFR; RP; RESISTENCIA ENDOCRINA; BREAST CANCER; FGF2; FGFR; PR; HORMONAL RESISTANCE
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