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Ver el documento (formato PDF)   Bianchi, Micaela.  "Mecanotransducción celular. Correlación entre las propiedades mecánicas y la organización-dinámica de proteínas de adhesión focal en células vivas"  (2016-03-28)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Las células pueden detectar, generar y responder a un amplio rango de señales externas, químicas y físicas, integrar y analizar esta información y, en consecuencia, cambiar su morfología, dinámica, comportamiento y, eventualmente, destino. A nivel celular, las respuestas biológicas a fuerzas externas se originan en dos tipos de estructuras especializadas: adhesiones focales (célula-matriz extracelular) y uniones adherentes (célula-célula). Las adhesiones focales son complejos de proteínas dispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular, a través de receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Estos sitios de adhesión son estructuras planas, alargadas de unos pocos micrones cuadrados que a menudo están localizadas en la periferia de las células, y que además funcionarían como organelas de señalización en el proceso de mecanotransducción celular. Uno de los retos que se presenta para estudiar el sistema es el de poder integrar y combinar distintas técnicas que nos permitan analizar la dinámica intracelular, la biomecánica de la célula/sustrato, detección de las fuerzas generadas en/por la célula, y observar la respuesta global de la célula en las distintas condiciones. Entonces, el estudio de la estructura, mecánica y dinámica de las proteínas de adhesiones focales en respuesta a un estímulo mecánico en células vivas requiere de técnicas que permitan visualizar y caracterizar en forma integrada la dinámica de eventos localizados en la célula. Estos métodos deben contar con una resolución espacio-temporal alta, de forma tal que permitan detectar eventos transientes y altamente localizados. En este contexto, se han implementado, en este trabajo de Tesis, distintas microscopías y espectroscopías de alta resolución espacial y temporal, en combinación con técnicas de biología molecular y celular. Con el objetivo de caracterizar las propiedades mecánicas de sustratos y células, en una primera etapa se implementó un modo de operación avanzado en microscopía de fuerza atómica (AFM), denominado PF-QNM (del inglés, Peak Force Quantitative Nanomechanical Property Mapping). Este modo permite obtener simultáneamente la imagen de topografía, junto con los mapas cuantitativos sobre las propiedades de elasticidad, adhesión, dureza, disipación de energía y deformación superficial. Se utilizaron sistemas modelo con distintas propiedades mecánicas de manera tal de cubrir el amplio rango que va desde GPa a kPa, y estudiar las propiedades de sustratos (vidrio, membranas de silicona y geles de poliacrilamina), así también como la línea celular utilizada en la Tesis. A nivel de adhesión focal, la estrategia fue transfectar células de epitelio mamario de ratón (HC11), con proteínas componentes de la adhesión (por ejemplo, zixina, FAK, vinculina, paxilina) fusionadas a proteínas fluorescentes visibles. De esta forma, empleando microscopías y espectroscopías de fluorescencia, es posible visualizar la expresión de las proteínas, registrar su localización y evolución en el tiempo y, mediante diferentes análisis, extraer información cuantitativa de dinámica, cinética y organización de los complejos de adhesión focal. El análisis de la dinámica y difusión de los complejos de adhesión focal y sus interacciones, fueron realizados mediante la espectroscopía por correlación de fluorescencia (FCS). Se caracterizaron los coeficientes efectivos de difusión de las proteínas mencionadas. El análisis de la correlación cruzada de las fluctuaciones de fluorescencia de pares de proteínas de adhesión focal (FCCS) permitió evidenciar la interacción entre distintas proteínas adhesivas de la adhesión focal. La cinética de disociación de proteínas desde la adhesión focal fue evaluada mediante la recuperación de la fluorescencia luego del fotoblanqueo (FRAP) en diferentes condiciones. Para estudiar los cambios generados en la organización y dinámica de adhesiones focales en células vivas en respuesta a un estímulo mecánico externo global, se empleó un dispositivo de tracción equibiaxial adaptado para ser usado en simultáneo con el microscopio confocal FV1000. La tensión mecánica aplicada por el dispositivo de tracción es capaz de inducir cambios en el área de las células vivas al igual que en las adhesiones focales. En respuesta al estiramiento mecánico se observó un mayor reclutamiento y translocación de la proteína zixina acompañado de una disminución significativa de su constante de disociación. Con el fin de correlacionar las propiedades mecánicas del sustrato y la fuerza de tracción generada por la célula a nivel de las adhesiones focales, sin perder de vista la organización y dinámica de las proteínas en la adhesión focal, se implementó la Microscopía de Fuerzas de Tracción (TFM). Esta técnica posee la sensibilidad necesaria para medir la fuerza de tracción generada por la célula sobre un sustrato elástico y transparente, la cual se puede combinar con otras técnicas de microscopía de fluorescencia como FRAP o FCS. El análisis de los datos TFM para la proteína zixina permitió obtener los mapas de deformación y de fuerzas de tracción, a la vez que se evaluó la cinética de disociación mediante FRAP.

Abstract:
Cells can detect, generate and respond to a wide range of external, chemical and physical signals, integrate and analyze this information and, consequently, change their morphology, dynamics, behavior and, eventually, their fate. At the cellular level, biological responses to external forces are originated from two types of specialized structures: focal adhesions (cell-extracellular matrix) and adherens junctions (cell-cell). Focal adhesions are protein complexes arranged in multi-molecular assemblies that bind extracellular matrix, through integral membrane receptors, to cytoskeletal components. These adhesion sites are flat, elongated and few square microns which are often located in the periphery of the cells, and also function as signaling organelles in the cellular mechanotransduction process. One of the challenges presented to study the system is to be able to integrate and combine different techniques that allow us to analyze the intracellular dynamics, biomechanics of the cell/substrate, detection of the forces generated in/by the cell, and observing the global response of the cell in different conditions. Thus, the study of the structure, mechanics and dynamics of focal adhesion proteins in response to a mechanical stimulus in living cells requires to visualize and characterize in an integrated way the dynamics of events located in the cell. These methods must have a high spatial and temporal resolution, so as to detect transients and highly localized events. In this context, they have been implemented in this thesis, different microscopies and spectroscopies with high spatial and temporal resolution, combined with the techniques of molecular and cell biology. In order to characterize the mechanical properties of substrates and cells, in a first step, an advanced mode operation was implemented in atomic force microscopy (AFM), called PF- QNM (Peak Force Quantitative nanomechanical Property Mapping). This mode allows simultaneously obtaining the topography, together with quantitative maps of the properties such as elasticity, adhesion, hardness, energy dissipation and surface deformation. Various systems were used with different mechanical properties so as to cover the wide range from GPa to kPa, and study the properties of substrates (glass, silicone membranes and polyacrylamide gels), as well as the cell line used in the Thesis. At focal adhesion level, the strategy was to transfect mouse mammary epithelial cells (HC11), with adhesion proteins (eg zixina, FAK, vinculin, paxillin) fused to visible fluorescent proteins. Thus, using fluorescence microscopy and spectroscopy, it is possible to visualize the expression of proteins, register their location and evolution over time and through different analysis, extract quantitative information about the dynamics, kinetics and organization of focal adhesion complexes. The analysis of the dynamics and distribution of focal adhesion complexes and their interactions were performed by fluorescence correlation spectroscopy (FCS). The effective diffusion coefficients of the proteins mentioned were characterized. The analysis of the crosscorrelation of fluorescence fluctuations of pairs of focal adhesion proteins (FCCS) allowed to demonstrate the interaction between various adhesive proteins in focal adhesion. The dissociation kinetics of proteins from the focal adhesion was evaluated by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) under different conditions. To study the changes generated in the organization and dynamics of focal adhesions in living cells, in response to a global external mechanical stimulus, an equibiaxial traction device adapted to be used simultaneously with the FV1000 confocal microscope was used. Mechanical tension applied by the pulling device is able to induce changes in the area of living cells as well as in focal adhesions. In response to mechanical stretch increased, the recruitment and translocation of the protein zyixin accompanied by a significant decrease in the dissociation constant was observed. To correlate the mechanical properties of the substrate and the traction force generated by the cell at a focal adhesions level, without losing sight of the organization and dynamics of proteins in focal adhesion, traction force microscopy was implemented (TFM). This technique has the sensitivity necessary to measure the traction force generated by the cell on an elastic and transparent substrate, which can be combined with other fluorescence microscopy techniques such as FRAP or FCS. Analysis of TFM data for zyxin yielded deformation and traction forces maps, while the dissociation kinetics was evaluated by FRAP.

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Registro:
Título : Mecanotransducción celular. Correlación entre las propiedades mecánicas y la organización-dinámica de proteínas de adhesión focal en células vivas     =    Cellular mechanotransduction. Correlation between mechanical properties and organization/dynamics of focal adhesion proteins in living cells
Autor : Bianchi, Micaela
Director : Pietrasanta, Lía I.
Consejero : Ponce Dawson, Silvina
Jurados : Arregui, Carlos  ; González Flecha, Francisco  ; Stefani, Fernando
Año : 2016-03-28
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Física
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Físicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5945_Bianchi
Idioma : Español
Area Temática : Física / Microscopía
Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : MICROSCOPIA DE FUERZA ATOMICA; ESPECTROSCOPIA DE FUERZA; MECANOTRANSDUCCION; CELULAS VIVAS; MICROSCOPIA DE FUERZAS DE TRACCION; ATOMIC FORCE MICROSCOPY; FORCE SPECTROSCOPY; MECHANOTRANSDUCTION; LIVING CELLS; TRACTION FORCE MICROSCOPY
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