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Ver el documento (formato PDF)   Gillanders, Florencia.  "Diheteroariletenos fluorescentes como sondas para microscopía de fluorescencia"  (2016-05-18)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Las técnicas modernas de microscopía de fluorescencia requieren sondas cuyos comportamientos fotoquímicos, combinados con las características ópticas del equipamiento, permitan resolver estructuras de dimensiones menores al límite impuesto por la difracción natural de la luz. Además de ser brillantes, estables, pequeñas y compatibles con el medio biológico, las sondas ideales fluorescen y se tornan oscuras de manera controlada y conocida. En esta tesis se diseñaron nuevas sondas basadas en los diheteroariletenos oxidados (DHAOs) como plataforma de fluorescencia controlada. Los DHAOs son compuestos fotocrómicos que presentan dos isómeros fotoestables, uno fluorescente y uno oscuro, alcanzados por irradiación con luz ultravioleta y visible respectivamente. Las propiedades espectroscópicas de los DHAOs se optimizaron estudiando el efecto de sustituyentes dadores y aceptores de electrones sobre las mismas. La demandante caracterización espectrofotométrica de los DHAOs se abordó con un espectrofotómetro y fotomodulador de construcción propia, el cual permitió automatizar las mediciones y explorar sistemáticamente diferentes condiciones de fotoconversión. Se descubrió que al aumentar el carácter dador de electrones del sustituyente, se estabiliza particularmente el estado excitado del isómero fluorescente, resultando en un aumento del desplazamiento de Stokes y un pronunciado solvatocromismo del fluoróforo. El solvatocromismo se utilizó para estudiar el cambio de polaridad del entorno de monómeros de α-sinucleína durante su agregación. A fin de conservar la fluoresencia fotomodulable de los DHAOs en agua, se exploraron diversas estrategias de solubilización con modificaciones covalentes y no-covalentes. La inclusión en cavidades de ciclodextrina, la adsorción a albúmina, y la funcionalización con grupos hidrofílicos sirvieron para solubilizar efectivamente a los DHAOs en medios acuosos. Las propiedades de fluorescencia y fotoconversión se retuvieron exitosamente dentro de la cavidad de las proteínas de unión de ácidos grasos y mediante la conjugación a entidades protéicas de mayor tamaño, indicando la preferencia de los DHAOs a un entorno protegido del agua. Anticuerpos secundarios conjugados a DHAOs se utilizaron para marcar β-tubulina en neuronas, y se lograron fotoconvertir selectivamente distintas áreas de las muestras en un microscopio que incorpora un arreglo programable para generar patrones espaciales de excitación. El particular comportamiento fotoquímico de los diheteroariletenos permitió desarrollar una estrategia para aumentar la resolución microscópica combinando DHAOs con fotocrómicos no-fluorescentes. Utilizando el fenómeno de transferencia de energía por resonancia de Förster, se postulan sondas que requieren de múltiples estímulos para la activación de la emisión, disminuyendo el volúmen de activación por debajo del límite de difracción de la luz y aumentando la resolución axial. La aplicación de las sondas sintetizadas y la propuesta de nuevas estrategias relacionadas con los DHAOs denotan el potencial que tienen los mismos en la búsqueda de mayor resolución en la microscopía de fluorescencia.

Abstract:
Modern fluorescence microscopy techniques require probes whose photochemical behaviour, combined with the optical characteristics of the microscope, enable the resolution of structures smaller than the natural diffraction limit of light. In addition to being bright, stable, small and compatible with the biological environment, the ideal probe’s fluorescence is activated and deactivated in a controlled and predictable manner. New probes were designed using oxidized diheteroarylethenes (ODHAs) as a platform for controlled fluorescence and are presented in this thesis. ODHAs are photochromic compounds with two photostable isomers, one fluorescent and one dark, which are formed upon irradiation with ultraviolet and visible light, respectively. In order to optimize their spectroscopic and photochemical properties, the ODHAs were modified with electron-donating and -withdrawing substituents. The demanding spectroscopic characterization of the photochromes was tackled with a custom built spectrophotometer and photoconverter, which enabled automatization of the measurements and the systematic exploration of varying photoconversion conditions. By increasing the electron-donating character of the substituents, the excited state of the fluorescent isomer is particularly stabilized, resulting in an increase in the Stokes shift and pronounced solvatochromism of the fluorophore. The solvatochromic ODHA was used to probe the changes in local polarity around monomers of the amyloid protein α-synuclein during their aggregation. Diverse solubilization strategies involving both covalent and non-covalent modifications were employed with the aim of conserving the photoswitchable fluorescence of ODHAs in water. Inclusion in cyclodextrin cavities, adsorption onto albumin, and functionalization with hydrophilic groups all served to effectively solubilize the ODHAs in aqueous solutions. The fluorescence and photoconversion properties were conserved inside the cavities of fatty acid binding proteins and by conjugation to larger protein entities, indicating the preference of the ODHAs for surroundings devoid of water. Secondary antibodies conjugated to ODHAs were used to immunostain β-tubulin in fixed neurons, and different areas of the sample were selectively photoconverted using structured illumination with a structured illumination (programmable array) microscope. A new strategy for increasing microscopic resolution was developed, harnessing the unique photochemical behaviour of diheteroarylethenes by combining ODHAs with non-fluorescent photochromes. The proposed probes require multiple stimuli for activation of the Förster resonance energy transfer-modulated emission, reducing the activation volume below the diffraction limit and increasing axial resolution. The application of the synthesized probes and the description of novel strategies related to ODHAs denote their potential in the search for increased resolution in fluorescence microscopy.

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Registro:
Título : Diheteroariletenos fluorescentes como sondas para microscopía de fluorescencia     =    Fluorescent diheteroarylethenes as probes for fluorescence microscopy
Autor : Gillanders, Florencia
Director : Jovin, Thomas
Consejero : Varela, Oscar
Jurados : Bonesi, Sergio  ; Lorente, Carolina  ; González Flecha, Francisco L.
Año : 2016-05-18
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Orgánica
Instituto Max Planck para Química Biofísica
Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Orgánica
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5997_Gillanders
Idioma : Español
Area Temática : Química / Fotoquímica
Química / Química Biológica
Química / Química Física
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