Tesis > Documento


Ver el documento (formato PDF)   Belingheri, Ana Verónica.  "Endocitosis rápida en células cromafines de ratón: mecanismos asociados, su regulación por Ca2+ y su participación en el reciclado vesicular"  (2016-09-22)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
URL:
     
Resumen:
En las células cromafines se han descripto varios tipos de endocitosis (clatrina dependiente, kiss and run, bulk endocitosis), las cuales contribuyen a la recuperación y el reciclado de la membrana plasmática, de sus proteínas, y de las vesículas que se han fusionado por exocitosis. En esta Tesis doctoral se ha medido electrofisiológicamente la endocitosis rápida en células cromafines de ratón, observándose dos modalidades. Por un lado, una endocitosis compensatoria que evoluciona con una única constante temporal rápida de ~8 seg, e internaliza aproximadamente la misma cantidad de membrana que fue exocitada durante la estimulación. Esta modalidad se dispara en respuesta a una entrada de Ca2+ menor a 79 pC (grupo LCG, por “low current group”). Por otro lado, se identificó una endocitosis en exceso que internaliza una cantidad de membrana mayor a la exocitada previamente, evolucionando con dos constantes temporales, una rápida de cinética similar a la del LCG y una ultra-rápida de ~0,6 seg. Esta última modalidad es disparada por una entrada de Ca2+ mayor a 79 pC (grupo HCG, por “high current group”). Por medio de la utilización de fármacos específicos, se demuestra en esta Tesis que la endocitosis rápida depende específicamente tanto de la entrada de Ca2+ a través de canales dependientes de voltaje (CCDV) de tipo L como del Ca2+ liberado desde el retículo endoplasmático. Además, la utilización de BAPTA demostró que la endocitosis rápida sería dependiente de una señal de Ca2+ localizada. Por otro lado, dos inhibidores del reclutamiento de clatrina inhibieron totalmente la endocitosis en el grupo LCG, y parcialmente en el grupo HCG. Esto sugiere que en este último grupo, se activaría un mecanismo clatrino-independiente. En HCG ambos componentes cinéticos se vieron afectados por los inhibidores de clatrina, sugiriendo que cuando la entrada de Ca2+ es muy alta la endocitosis clatrina-dependiente puede evolucionar a velocidades aún no reportadas en la literatura. Finalmente, experimentos de imaging con FM1-43 mostraron que la endocitosis en exceso inducida por una despolarización con alto K+ se compone de una fracción reciclable a vesículas liberables y de otra no reciclable en un período de 30 minutos, siendo la primera inhibida parcialmente por un bloqueante del reclutamiento de clatrina. Estos resultados en su conjunto nos permiten sugerir un modelo en el cual: (a) la entrada localizada de Ca2+ por CCDV tipo L induce la liberación de más Ca2+ del retículo endoplásmico. (b) El consecuente aumento de este catión induce la activación de una endocitosis clatrina dependiente, que debido a su Ca2+ dependencia se muestra muy rápida al comienzo mientras el Ca2+ alto persiste en el citosol, y más lenta luego de que la concentración citosólica del catión ha disminuido. Esto explicaría la clatrino dependencia de ambos componentes. (c) Esta endocitosis clatrina dependiente resulta parcialmente en la generación de nuevas vesículas liberables. (d) La gran entrada de Ca2+ en el grupo HCG induciría además la activación de un proceso clatrina independiente, que no se recicla en vesículas liberables en los tiempos del experimento.

Abstract:
Chromaffin cells have various types of endocytosis (clathrin-dependent, kiss and run, bulk endocytosis), which allow the recovery and recycling of membrane and proteins of the previously fused vesicles. We measured two modes of rapid endocytosis in mouse chromaffin cells. On one hand, compensatory endocytosis (compensates approximately the same amount of membrane that was added during stimulation) is associated with a Ca2+ entry lower than 79 pC (LCG group) and a single time constant of ~8 sec. On the other hand, excess retrieval (the endocytosis surpasses the amount of the previously exocytosed membrane), is triggered by a Ca2+ entry bigger than 79 pC (HCG group) and has two time constants, a fast one (~8 sec) and an ultrafast one (~0,6 sec). The results of this Thesis show that the activation of rapid endocytosis is dependent on a localized Ca2+ signal, and specifically depends on Ca2+ influx through L-type voltage dependent Ca2+ channels (VDCC) and Ca2+ released from the endoplasmic reticulum. Additionally, we found that rapid endocytosis is clathrin dependent, almost entirely for the LCG group, and partially for the HCG group. Particularly in HCG, it is interesting that clathrin specific blockers inhibited the fast, but also the ultrafast component, what suggests that clathrin dependent endocytosis can progress at rapid speeds not previously reported when the Ca2+ entry is very big. The electrophysiological study on endocytosis was complemented with experiments of imaging using the membrane fluorescent probe FM1-43. After applying a high K+ depolarization that allows a large Ca2+ influx, we recorded an endocytosis that surpassed the previous exocytosis. We found that the internalized membrane was partially recycled to releasable vesicles, by a mechanism that is at least in part clathrin dependent. There was also a large internalized membrane fraction which was not releasable during the experimental period. We propose a tentative model in which: (a) Ca2+ entry through L-type VDCC triggers the release of more Ca2+ from endoplasmic reticulum; (b) the resulting increase of Ca2+ activates a rapid clathrin dependent endocytosis, and particularly in HCG the higher Ca2+ concentration during the first hundreds of milliseconds after the stimulus provokes the appearance of the ultrafast component; (c) clathrin dependent endocytosis partially results in the generation of new releasable vesicles in less than 30 min; (d) in HCG, the high Ca2+ entry also provokes the activation of a clathrin independent endocytosis that does not produce releasable vesicles in the experimental period.

* A este resumen le pueden faltar caracteres especiales. Consulte la versión completa en el documento en formato PDF

Registro:
Título : Endocitosis rápida en células cromafines de ratón: mecanismos asociados, su regulación por Ca2+ y su participación en el reciclado vesicular     =    Rapid endocytosis in mouse chromaffin cells: mechanisms, Ca2+ regulation and vesicle recycling
Autor : Belingheri, Ana Verónica
Director : Marengo, Fernando Diego
Consejero : Uchitel, Osvaldo Daniel
Jurados : Piriz, Joaquín  ; Pagani, Mario R.  ; Katz, Eleonora
Año : 2016-09-22
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular (FBMC). Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular (LFBM)
Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias (IFIBYNE). Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular (LFBM)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_6083_Belingheri
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : ENDOCITOSIS RAPIDA; CA2+; EXOCITOSIS; CLATRINA; DINAMINA; KISS AND RUN; BULK ENDOCITOSIS; RAPID ENDOCYTOSIS; CA2+; EXOCYTOSIS; CLATHRIN; DYNAMIN; KISS AND RUN; BULK ENDOCYTOSIS
URL al Documento : 
URL al Registro : 
hola chau _gs.DocumentHeader_ chau2 _documentheader_ chau3
Estadísticas:
     http://digital.bl.fcen.uba.ar
Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria - Pabellón II - C1428EGA - Tel. (54 11) 4789-9293 int 34