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Ver el documento (formato PDF)   Bordenave, Martín Diego.  "Mediciones con resolución nanométrica mediante depleción por emisión estimulada"  (2016-11-14)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Desde los estudios de Ernst Abbe, a finales del siglo XIX, se dio por aceptado que la microscopía óptica de campo lejano tenía un límite en su poder de resolución espacial: objetos que se encontraran más cercanos entre sí que media longitud de onda de la luz utilizada no podrían distinguirse. Sin embargo, en las últimas dos décadas se han desarrollado un número de técnicas basadas en fluorescencia que mantienen las ventajas de la microscopía óptica de campo lejano, y proporcionan una resolución espacial limitada únicamente por el tamaño del marcador fluorescente. Estas técnicas se denominan microscopías de superresolución o nanoscopías de fluorescencia e involucran la transición entre estados moleculares de los fluoróforos que permitan o no la emisión de fluorescencia. En particular, en la nanoscopía STED (Stimulated Emission Depletion), se produce esta transición mediante depleción por emisión estimulada, con el fin de desactivar fluoróforos en regiones controladas del espacio y de esta forma reducir el volumen efectivo de observación. En el marco de esta tesis, y gracias a una colaboración formal y activa con Stefan W. Hell (Department of NanoBiophotonics, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany), galardonado en 2014 con el premio Nobel de Química por su trabajo pionero en las nanoscopías de fluorescencia, se construyó el primer nanoscopio STED de Argentina (Grupo de Nanofísica Aplicada, Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires (BA), Argentina). El nanoscopio STED se aplicó para indagar y dilucidar problemas biofísicos con resolución nanométrica. En colaboraciones interdisciplinarias se estudió: (a) la organización de proteínas en la membrana del Trypanosoma cruzi, en colaboración con el Grupo de Inmunología Molecular, Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB), Universidad Nacional de San Martín (UNSAM), CONICET, BA, Argentina; (b) procesos de reestructuración del citoesqueleto de los conos de crecimiento durante la polarización neuronal, en colaboración con el Laboratorio de Neurobiología, Instituto de Investigación Médica de Córdoba (INIMEC), CONICET, Córdoba, Argentina; y (c) la formación y estabilidad de estructuras periódicas de actina en procesos de degeneración axonal, en colaboración con el Laboratorio de Neurobiología, INIMEC, CONICET, Córdoba, Argentina y el Grupo de Neurobiología Molecular, Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires (IBIOBA), CONICET, BA, Argentina. Asimismo, se desarrolló un nuevo esquema de implementación de la nanoscopía STED que expande considerablemente su campo de aplicación. Generalmente, luz de longitud de onda situada en la zona roja lejana del espectro de emisión del fluoróforo es utilizada para inducir el fenómeno de emisión estimulada. En esta tesis, se demuestra que STED continuo (CW) también es posible utilizando longitudes de onda de STED ubicadas en el máximo de emisión, donde la sección eficaz de emisión estimulada puede ser hasta 10 veces mayor. Como resultado, es posible obtener imágenes de STED utilizando potencias proporcionalmente menores. Además, fluoróforos que se consideraban inadecuados para ciertas configuraciones espectrales de nanoscopía STED, pueden ser utilizables.

Abstract:
Since the studies made by Ernst Abbe, by the end of the XIXth century, it was accepted that far field optical microscopy had a limit in its spatial resolution: objects found closer together than half the wavelength of the light used would not be distinguished apart. However, in the last two decades, a number of techniques based on fluorescence have been developed, that keep all the advantages of far-field optical microscopy and provide spatial resolution only limited by the size of the fluorescent marker. These techniques are called super-resolution fluorescence microscopies or fluorescence nanoscopies and they involve the transition between molecular states of the fluorophores that allow or not fluorescence emission. Particularly, in STED (Stimulated Emission Depletion) nanoscopy, this transition is produced by stimulated emission depletion, in order to disable fluorophores in controlled regions of space and thereby reduce the effective volume of observation. In the framework of this thesis, and supported by a formal and active collaboration with Stefan W. Hell (Department of NanoBiophotonics, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany), awarded in 2014 with the Nobel Prize in Chemistry for his pioneering work in fluorescence nanoscopies, the first STED nanoscope of Argentina was built (Grupo de Nanofísica Aplicada, Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires (BA), Argentina). The STED nanoscope was applied to investigate and elucidate biophysical questions with nanometric resolution. In interdisciplinary collaborations it was studied: (a) the organization of proteins in the membrane of Trypanosoma cruzi, in collaboration with the Group of Molecular Immunology, Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB), Universidad Nacional de San Martín (UNSAM), CONICET, BA, Argentina; (b) processes of cytoskeleton restructuring in growth cones during neuronal polarization, in collaboration with the Laboratory of Neurobiology, Instituto de Investigación Médica de Córdoba (INIMEC), CONICET, Córdoba, Argentina; and (c) the formation and stability of periodic structures of actin in the process of axonal degeneration, in collaboration with the Laboratory of Neurobiology, INIMEC, CONICET, Córdoba, Argentina and the Group of Molecular Neurobiology, Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires (IBIOBA), CONICET, BA, Argentina. Also, a new implementation scheme of STED nanoscopy was developed, which expands considerably its field of application. Generally, light of a wavelength located in the far-red zone of the emission spectrum of the fluorophore is used to induce stimulated emission. In this thesis, it is shown that continuous wave STED (CW), is also feasible using STED wavelengths located at the maximum of emission, where the stimulated emission cross section can be up to 10 times higher. As a result, super-resolved STED images are obtained using proportionally less power. Also, fluorophores considered unsuitable for certain spectral configurations of STED nanoscopy, may become usable with this scheme.

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Registro:
Título : Mediciones con resolución nanométrica mediante depleción por emisión estimulada     =    Measurements with nanometric resolution by stimulated emission depletion
Autor : Bordenave, Martín Diego
Director : Stefani, Fernando D.
Consejero : Bragas, Andrea V.
Jurados : Iemmi, Claudio  ; Aramendía, Pedro  ; Barrantes, Francisco J.
Año : 2016-11-14
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Física
Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Físicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_6095_Bordenave
Idioma : Español
Area Temática : Física / Microscopía
Palabras claves : MICROSCOPIA; NANOSCOPIA; STED; RESOLUCION; SUPERRESOLUCION; MICROSCOPY; NANOSCOPY; STED; RESOLUTION; SUPER-RESOLUTION
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