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Ver el documento (formato PDF)   Cromberg, Lucas Eneas.  "Estudio del rol del transporte axonal en la via nigroestriatal en ratones knockout condicionales del motor molecular kif5b"  (2017-04-04)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Los ganglios basales son una cadena de núcleos subcorticales que facilitan la coordinación motora. Las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra pars compacta modulan la actividad de de las neuronas GABAérgicas del estriado que son inervadas por la corteza motora. En el estriado conviven dos tipos de neuronas GABAérgicas. Las de la vía directa, que expresan los receptores dopaminérgicos D1 estimulando los movimientos y las de la vía indirecta, que expresan los receptores dopaminérgicos del tipo D2, cuya función es inhibir los movimientos. Para la iniciación de los movimientos se requiere la activación conjunta de ambas vías. La enfermedad de Parkinson es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común. Se caracteriza por la muerte progresiva de las neuronas dopaminérgicas, la cual genera fallas en la coordinación motora, defectos en la postura y problemas para el inicio de los movimientos. La enfermedad de parkinson está caracterizada patológicamente por el agregado intracelular de los cuerpos de Lewy (formados por α-synucleína) y los ovillos neurofibrilares (formados por la proteína tau en estado hiperfosforilado). Estas marcas de patología sugieren que defectos en el sistema de transporte axonal podrían estar involucrados en la enfermedad. Las neuronas dopaminérgicas son células con una alta polarización que les permite conectar con neuronas localizadas a grandes distancias. Esta polarización las hace depender de un complejo sistema de transporte compuesto por microtúbulos, motores moleculares y cargas. Kinesina-1 es un motor molecular anterógrado que lleva las cargas hacia el cono axonal. Es un heterotetrámero de dos subunidades pesadas (KHC) que interactúan con los microtúbulos y dos subunidades livianas (KLC) que interactúan con las cargas directamente o a través de proteínas adaptadoras. Existen tres genes que codifican para KHC, kif5a y kif5c que se expresan en el sistema nervioso y kif5b de expresión ubicua. Trabajos previos demostraron que ratones con defectos en la expresión del motor molecular KLC1 desarrollan patologías axonales con agregados de proteínas. Por otro lado, la deleción de kif5b resulta letal y los ratones knockout mueren en el día embrionario 11.5 sin embargo su rol específico en el sistema nervioso no está esclarecido. El objetivo de este trabajo es estudiar el rol específico de la subunidad Kif5b del motor molecular Kinesina-1 en la vía nigroestriatal. Se generaron ratones con deleción de la expresión del motor molecular kif5b de forma condicional en neuronas del sistema nervioso central, usando el sistema cre-loxp dirigido mediante el promotor de nestina (5b fl/fl nes cre/+) para cumplir este objetivo. Experimentos de análisis del movimiento en el campo abierto y en el rotarod determinaron que los ratones 5b fl/fl nes cre/+ presentan fallas en su actividad exploratoria y defectos en la coordinación motora. Por su parte, los niveles de dopamina no se habían visto afectados, sin embargo hubo una disminución en los niveles de degradación de dopamina, evidenciándose en una menor concentración del producto de degradación dopac. Estos resultados sugirieron un rol importante del motor kif5b en la vía nigroestriatal y en el metabolismo de dopamina. Para testear si los defectos en el metabolismo de dopamina eran la causa de los defectos en la locomoción se realizó una deleción condicional de kif5b específicamente en neuronas dopaminérgicas. Sorprendentemente, la deleción de Kif5b específica no indujo alteraciones en la respuesta locomotora sugiriendo que los defectos presinápticos no son suficientes para evidenciar defectos de coordinación o hipolocomoción. Para comprender si fallas en la locomoción se debían a problemas en la liberación de dopamina, esta se estimuló mediante la inyección de los ratones 5b fl/fl nes cre/+ con anfetamina. La estimulación con anfetamina, indujo un incremento en la distancia recorrida en ambos genotipos, permitiendo a los ratones 5b fl/fl nes cre/+ alcanzarla distancia obtenida por los ratones control estimulados. Para determinar si la actividad de las vías directa e indirectas del estriado se encontraban afectadas por la deleción de kif5b se analizó la motricidad de los ratones en el campo abierto, utilizando agonistas y antagonistas de los receptores D1 y D2. El antagonista de los receptores D1 (SCH 23390) y el agonista de los receptores D2 (quinpirole) disminuyeron la distancia recorrida en los ratones 5b fl/fl nes cre/+ y control. Sin embargo, bajo la estimulación con anfetamina, los ratones 5b fl/fl nes cre/+ resultaron insensibles al tratamiento con quinpirole o con un antagonista de los receptores D2 (risperidona), mientras que si se observó una respuesta en los animales control. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la expresión de kif5b es necesaria para el correcto recambio de dopamina y para la presentación de los receptores D2 en la membrana plasmática de las neuronas estriatales permitiendo el correcto desarrollo de la capacidad motora. A partir de los resultados obtenidos en este trabajo, sugerimos que kif5b tiene un rol específico en el metabolismo de dopamina a la vez que su expresión es necesaria para la actividad de los receptores dopaminérgicos del tipo D2. Kif5b es imprescindible para el correcto funcionamiento de la vía nigroestriatal y la locomoción.

Abstract:
The basal ganglia are a group of subcortical nuclei responsible of the motor coordination. Dopaminergic neurons from the sustancia nigra pars compacta modulate the activity of the GABAergic neurons from the striatum which are innervated by cortical neurons. In the striatum coexist two types of GABAergic neurons. Neurons from the direct pathway express dopamine receptors D1 like and stimulate movement, while GABAergic neurons from the indirect pathway express dopamine receptors D2 like and inhibit movement. Activation of both pathways is required for movement initiation. Parkinson’s disease is the second most common neurodegenerative disorder. It is characterized by the dopaminergic cell neurodegeneration which induce motor coordination failures, postural instability, and impairments in the initiation of movements. Parkinson’s disease pathological hallmarks include intracellular accumulation of Lewy Bodies (composed of α-synuclein) and neurofibrillary tangles (composed of hyperphosphorilated tau). These hallmarks suggest that impairments in the axonal transport system could be related to the disease. Dopaminergic neurons are highly polarized cells. Such polarization allows them to connect with other cells localized far away from the soma. However this morphology depends on a complex transport system composed by microtubule tracks, molecular motors and cargoes. Kinesin-1 is a molecular motor which carries cargoes toward the axonal growth cone. Kinesin-1 is an heterotretamere composed by two heavy subunits (KHC) which interact with the microtubules and two light subunits (KLC) which interact with the cargoes directly or through adaptor proteins. There are three genes coding for KHC, kif5a and kif5c expressed in the nervous system and the ubiquitously expressed kif5b. Previous publications have demonstrated that deletion of the KLC1 molecular motor in mice help the development of axonal pathologies with protein accumulation. Kif5b deletion is lethal and knockout mice die in the embrionary day 11.5. However the specific role of kif5b in the nervous system remains unknown. The objective of this work is to study the role of the kif5b subunit of the molecular motor Kinesin-1 in the central nervous system. Conditional transgenic mice with deficits in kif5b expression in neurons were generated with the cre-loxp system directed under the nestin promoter (5b fl/fl nes cre/+) to fulfill this objective. Movement analysis in the open field and rotarod assays determined that 5b fl/fl nes cre/+ have defects in the spontaneous exploratory activity and in motor coordination. Dopamine levels did not change, however a decrease in the concentration of the dopamine degradation product, dopac was observed, indicating a lower degradation rate of the internalized dopamine. These results suggested an important role of the molecular motor kif5b in the nigrostriatal pathway activity and dopamine metabolism. To analyze if dopamine metabolism impairments were the cause of the locomotion defects, we deleted kif5b from presynaptic dopaminergic neurons. Surprisingly, the specific deletion of kif5b did not induced alterations in the motor response suggesting that presynaptic defects are not sufficient to evidenciate coordination impairment or hipolocomotion. In order to understand if dopamine releasing was impaired, mice were injected with amphetamine to stimulate it. Amphetamine stimulation increased run length by both mice and remarkably 5b fl/fl nes cre/+ mice achieved the same distance run by stimulated control. To determine if the activity of the direct and indirect pathway were impaired, 5b fl/fl nes cre/+ mice were the antagonist of the dopamine receptor D1 (SCH 23390) and the agonist of the dopamine receptor D2 (quinpirole) decreased run length in both genotypes. However under amphetamine stimulation 5 fl/fl nes cre/+ mice were not sensitive to quinpirole or to the D2 antagonist (risperidone) treatment, while control mice responded to both drugs. All together the results obtained in this work, we suggest that kif5b has a specific role in the dopamine metabolism and its expression is necessary for the D2 receptors activity. Kif5b is fundamental for the proper function of the nigrostriatal pathway and locomotion.

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Registro:
Título : Estudio del rol del transporte axonal en la via nigroestriatal en ratones knockout condicionales del motor molecular kif5b     =    Axonal transport role in the nigrostriatal in conditional knockout mice of the molecular motor kif5b
Autor : Cromberg, Lucas Eneas
Director : Falzone, Tomás Luis
Consejero : Uchitel, Osvaldo D.
Jurados : Urbano, Francisco J.  ; Pigino, Gustavo  ; Paratcha, Gustavo
Año : 2017-04-04
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencias, Prof. E. De Robertis (IBCN)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_6138_Cromberg
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Neurociencias
Palabras claves : KIF5B; VIA NIGROESTRIATAL; RECEPTORES DOPAMINERGICOS; DOPAMINA; LOCOMOCION; KIF5B; NIGROSTRIATAL PATHWAY; DOPAMINE RECEPTORS; DOPAMINE; LOCOMOTION
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