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Ver el documento (formato PDF)   Barabas, Federico M..  "Nanoscopía de fluorescencia por localización estocástica de moléculas individuales"  (2017-03-27)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Hasta hace unos 20 años se creía que la difracción de la luz imponía un límite fundamental de unos 200 nm a la resolución espacial de un microscopio óptico. Las nanoscopías de fluorescencia, también llamadas microscopías de superresolución, han quebrado esta barrera y permiten en teoría alcanzar la máxima resolución espacial con sentido físico, es decir el tamaño mismo de la fuente de luz. En la práctica, sin embargo, la resolución se ve limitada a unos 20 nm por efecto de variables experimentales como la relación señal-ruido y el fotoblanqueo de los marcadores fluorescentes. Además, las nanoscopías de fluorescencia mantienen las ventajas de la microscopía de fluorescencia tradicional, como el acceso poco invasivo y la alta sensibilidad y especificidad. Se denomina "localización de una molécula individual" al proceso numérico por el cual se extrae la posición de un emisor único a partir de la medición de su patrón de intensidad. La nanoscopía por localización estocástica de moléculas individuales (o simplemente "nanoscopía por localización") consiste en la adquisición secuencial de imágenes en las que en cada una un subconjunto estocástico de los fluoróforos de una muestra son resueltos individualmente. Como los patrones de emisión no se superponen, la precisión de localización solo depende del número de fotones detectados de cada emisión. La imagen final se construye con las posiciones de cada fluoróforo previamente localizado. Para obtener una imagen de superresolución es necesario que los marcadores estén separados por distancias menores a su imagen limitada por difracción y que éstos emitan de manera intermitente (que se enciendan y apaguen), de manera que en algún momento puedan observarse individualmente. La nanoscopía por localización comprende a un conjunto de técnicas diferenciadas entre sí de acuerdo al mecanismo que permite el encendido y apagado de los marcadores fluorescentes. En la presente Tesis se estudian aspectos fundamentales e instrumentales de la nanoscopía por localización y se la aplica al estudio de preguntas biológicas. En el Capítulo 1 se desarrollan los conceptos fundamentales y limitaciones de la microscopía de uorescencia, y se introducen las técnicas de superresolución. En el Capítulo 2 se detallan los métodos y estado del arte de la nanoscopía por localización. En el Capítulo 3 se caracteriza el nanoscopio por localización con posibilidad de obtener imágenes en 3D y a dos colores de emisión, que fuera construido como parte del trabajo de Tesis. Finalmente, en los Capítulos 4 y 5 se describen aplicaciones de dicho nanoscopio en dos proyectos de relevancia biológica: el estudio en neuronas hipocampales de la estructura periódica de espectrina y la distribución espacial de proteínas presentes en la membrana del Trypanosoma cruzi que median la interacción entre el parásito y el huésped.

Abstract:
Until twenty years ago it was considered that the diffraction of light imposed a fundamental limit of around 200 nm to the resolution of an optical microscope. Fluorescence nanoscopy, also known as super-resolution uorescence microscopy, has overcome this limit. It achieves the theoretical maximum spatial resolution, which is the size of the light source itself. In practice, however, the resolution is limited to around 20 nm by experimental factors like the signal-to-noise ratio and the photobleaching of uorescent markers. Besides, fluorescence nanoscopy maintains the advantages of traditional fluorescence microscopy, like its low invasivity and its high sensitivity and specificity. Single-molecule localization is the numerical process that extracts the single molecule position from measuring its emission pattern. Sigle-molecule stochastic localization nanoscopy (or simply "localization nanoscopy") consists of the sequential acquisition of images of well separated fluorophores from a stochastic subset of all fluorophores in the sample. As their emission patterns do not overlap, the position of each molecule can be determined with a precision only limited by the number of detected photons. A final super-resolved image is reconstructed from the localizations of all the fluorophores of the sequence of images. In order to obtain a super-resolved image, it is essential to have fluorescent markers closer to each other than the diffraction limit. Also, they must intermittently switch on and off, so that at a given point in time they can be imaged individually. Stochastic localization nanoscopy denotes a group of techniques each with a different mechanism for the on-off switching of the fluorophores. In this thesis we study fundamental and instrumental aspects of localization nanoscopy and we apply it to the study of biological questions. In Chapter 1 the fundamental concepts, potential and limitations of fluorescence microscopy are presented, followed by an introduction to super-resolution techniques. The fundamental principles and methods of single-molecule localization fluorescence nanoscopy are explained in detail in Chapter 2. Chapter 3 gives a complete description of the nanoscope built as part of this thesis work at the Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION), along with guidelines for its operation and an illustration of its performance. In Chapters 4 and 5 two biological applications of the nanoscope are presented, that address nanoscale organization proteins: firstly, the quantification of the periodic spectrin structure present in hippocampal neurons and secondly, the spatial distribution of proteins on the outer membrane of the Trypanosoma cruzi that mediate the parasite-host interaction. Finally, the conclusions of this thesis and future perspectives are unfolded in Chapter 6.

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Registro:
Título : Nanoscopía de fluorescencia por localización estocástica de moléculas individuales     =    Single-molecule stochastic localization fluorescence nanoscopy
Autor : Barabas, Federico M.
Director : Stefani, Fernando D.
Consejero : Bragas, Andrea
Jurados : Barrantes, Francisco  ; Grecco, Hernán  ; Bilmes, Gabriel
Año : 2017-03-27
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Física
Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION)
Grado obtenido : Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Físicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_6197_Barabas
Idioma : Inglés
Area Temática : Física / Óptica
Física / Microscopía
Palabras claves : FLUORESCENCIA; MICROSCOPIA; SUPERRESOLUCION; OPTICA; NANOSCOPIA; FLUORESCENCE; MICROSCOPY; SUPER-RESOLUTION; OPTICS; NANOSCOPY
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