Resumen:
En este trabajo se ha analizado la operación del cielo delácido citrico en las levaduras (Saccharamoymyces Cerevisiae)llevando a cabo incubaciones con: 1)Ácido acético-1-C^14 , sin y con DNP como inhibidor. 2)Ácido acético-2-C^14 y glucosa, en atmósfera de nitrógeno. 3)Ácido acécito-2-C^14 , y antimicina A, con y sin glucosa. Se ha estudiado la distribución intramolecular del C^14 en moléculasde ácido glutámico provenientes de estas incubaciones. Se ha elegido el ácido glutámic, a pesar de no ser un verdadero intermediario en el ciclo del ácido cítrico, porque se forma, portransaminación, a partir de uno de ellos: el ácodp alfa-cetoglutárico,y porque suele encontrarse, en la célula, en una concentración mayor de la que habitualmente se encuentra el ácido alfa-cetoglutárico. Presenta además una estructura bastante simple. Se ha elaboradao un método para degradar la molécula de ácidoglutámico en forma completa, trabajando con cantidades del orden de 25-30 mg. El ácido glutámico proveniente del metabolismo de la levadura, se ha eluido del papel donde, por cromatografía bidimensional, selo había separado de los otros metabolitos, se lo había localizado por su imagen radiográfica y se lo había identificado por comparación con un patrón inerte.(Esta parte previo fue realizada por el Dr.Stoppaniy otros colaboradores). La actividad de la mancha de ácido glutámico en el cromatogramaa se ha medido con un tubo tipo Scott, lleno con gas de Geiger, y la medidase ha corregido respecto al efecto cero, al período refractario del tubo y se ha referido a un patrón de C^14 al que se le ha atribuidouna actividad de 700 cuentas por minuto. En el eluido se ha medido la radioactividad sobre una alícuota (50-200lambdass) en plancheta de aluminio. En el experimento con -1-C^14 , eleluido remanente se ha dividido en dos fracciones: en una de ellas se han llevado a cabo determinaciones colorimétricas segun Russel, con nafto-quino-sulfonato de sodio y con la otra se ha continuado la degradación.En los experimentos con -2-C^14 , todo el eluido se ha utilizado para realizar la degradación. En ambos casos, la fracciónde eluido destinada a la degradación se ha dividido en tres alícuotaspara llevar a cabo las siguientes reacciones: Combustión total, que permite calcular la actividad total del ácidoglutámico. Decarboxilación del ácido glutámico por acción de la cloramina-T, que libera el C1. Decarboxilación del ácido glutámico según la reacción de Schmidt,que libera C5. En estas reacciones el ácido glutámico radioactivo, eluido del cromatograma, se ha diluido con droga inerte. En igual forma se haprocedido con los demás productos de degradación que se han aislado y sometido a sucesivas degradaciones. La combustión total se ha realizado según Vn Slyke y col. en el aparato de Lindenbaum y col. (Capítulo 1). La decarboxilación con cloramina-T, según Kemble y Macpherson(Capítulo 2), en manómetros de Warburg, fijando el anhídrido carbónico en hidróxido de sodiodiluido al medio, colocado en la copita central del manómetro. La decarboxilación según Schmidt (Capítulo 3), en un aparato apropiado,fijado el anhídrido carbónico en hidroxido de sodio 2N. El ácido 2-4-diaminobutírico, producto de la degradación del ácido glutámico sometido a la reacción de Schmidt, se ha aislado comodiclorhidrato por cromatografía en columna (resina Dowex-50) e identificado por su punto de fusión (Capítulo 4). Luego se ha oxidado con óxido de plata dando beta-alanina yliberando el C1. (Capítulo 4). Esta reacción no ha podido utilizarsecomo medida del C1 liberado, éste se ha determinado como ya se ha dicho, por decarboxilación del ácido glutámico con cloramina-T. La beta-alanina se ha separado de la mezcla de reacción al estadode clorhidrato por cromatografía en columna (Resina Dowex-50), y luego como beta-alanina, usando la misma resina y eluyendo con amoníaco. Se ha identificado por su punto de fusión (Capítulo 4). La beta-alanina aislada se ha sometido a una fusión alcalina (Capítulo 5) que ha liberado el C4 y originado acetato de sodio. Esta reacción no ha sido útil como medida del C4 liberado pues la índole de la misma, llevada a cabo en mufla, no lo ha permitido. Este carbono se ha determinado por diferencia. El acetato de sodio obtenido se ha aislado al estado de ácido acético,identificado por las constantes de Duclaux, y transformado en acetatode sodio. Se lo ha sometido a la reacción de Schmidt, que ha liberadoel C2 y dejado como residuo la metilamina, cuyo carbono corresponde al C3 del ácido glutámico original. Dicha metilamina se ha recuperado como sulfato y oxidado con solución de nitrato de plata y persulfato de potasio (Capítulo 6), en aparato apropiado, recogiendo el anhídrido carbónico desprendidoen hidróxido de sodio 2N. Los carbono que se han ido liberando, salvo el C4, se han precipitado al estado de carbonato de bario, y los productos de degradación que se han aislado: diclorhidrato de ácido 2-4-diaminobutírico, beta-alanina, y acetato de sodio, se han sometido, igual que el ácido glutámico original, a una combustión total, precipitándose también el anhídrido carbónico producidoal estado de carbonato de bario. Estos carbonatos se han centrifugado, lavado, filtadao (Distribuyéndose uniformemente), pesado y contado su radioactividad en el escalímetro. La radioactividad correspondiente a cada carbono se ha conocido así en formadirecta y por diferencia, salvo la del C4, que sólo se ha calculado por diferencia. La actividad del eluido original y de los carbonatos de bario se han medidosobre plancheta de aluminio con tubo Geiger-Muller con ventana terminal delgadade micam conectada a un escalímetro decimal. Los resultados se han corregido respecto al efecto cero, al período refractario del tubo y uniformado respectoal patrón ya citado. Las lecturas correspondiente a los carbonatos de bario se han corregido también respecto a la auto-adsorción, ( corrección innecesaria en el caso del eluido) y los resultados se han expresado espesor nulo. En los experimentos con -1-C^14 , la cantidad de ácido glutámico por miligramo de célula aumenta al principio de la oxidación, para disminuir ulteriormente. Que se produce un fuerte aumento de la actividad específica, notable en el último período de la oxidación. En presencia de DNP, que impide la incorporaciónde acetato por levadura, este aumento no sólo se detiene, sino que se observauna disminución. Cuando se utiliza acetato-1-C^14, la rotulación del ácido glutámicotiene lugar preferentemente en los carbonos 1 y 5, y su suma representa casi la totalidad. La proporción en el C1 es baja al principio y luego crece hasta 30-35% (Capítulo 7). Los carbonos intermedios no son rotulados en forma significativa. Cuando se utiliza acetato-2-C^14 , la rotulación tiene lugar en los carbonos 2, 3 y 4,siendo mayor en el C4. En los carbonos 1 y 5 resulta prácticamente nula. Estos resultados evidencian que, en las condiciones en que se han llevado a cabolas incubaciones, funciona el ciclo del ácido cítrico en las levaduras (Saccharomyces Cerevisiae).
Citación:
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Pigretti, María Martha. (1960). Degradación completa del ácido glutámico en escala 25-30 mg. aplicable al análisis isotópico del mismo : Aplicaciones. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1048_Pigretti
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Pigretti, María Martha. "Degradación completa del ácido glutámico en escala 25-30 mg. aplicable al análisis isotópico del mismo : Aplicaciones". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1960.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1048_Pigretti
