Resumen:
1- Objeto del trabajo. La determinación da vitamina B12 en caldos de fermentación se realizacorrientemente por e1 método microbiológico con Lactobacillus leichmanii, que es el que mejor reproduce la activudad biológica de dichas muestras, pero presenta una serie de dificultades de orden técnico y además es uno de los métodos biológicos más susceptibles a variaciones fortuitas. El objetivo del presente trabajo es estudiar un método químico de rápida y segura ejecución, que permita seguir la curva de producción del método microbiológico, reemplzándolo. Para ello, se hizo revisión bibliográfica exhaustiva de los métodos químicos, seleccionando un método absorciométrico desarrollado por Rudkin-Taylor y efectuando la comparación. 2- Parte experimental. 1) En primer lugar, se estudiaron espectrofotométricamente los cristales de vitamina B12 patrón, determinando la relación de absorbancias A361/A278 y A361/A550, obteniéndose valores que cumplían con los límites teóricos. Además, se determinó la pureza de los cristale, resultando un valor de 95,8% que cumple con el mínimo requerido, que es 95%. 2) Se calibró el espectrofotómetro Beckman con soluciones de vitamina B12 patrón y complejos dicianuro, con el objeto de determinar el valor - ΔE1cm^1% a 582 mμ que resultó igual a 58,8. El método absorciométrico de Rudkin-Taylor se basa en la diferencia a 582 mμ entre los espectros de vitamina B12 y su complejo dicianuro, siendo necesario la calibracióndel aparato con soluciones patrón para evitar tener errores superiores al 10%. 3) A continuación se hizo un estudio comparativo de los métodos microbiológicos y químicos sobre distintos caldos. Se determinaron 24 caldos de fermentación por ambos métodos, 14 al ser cosechados y 10 en diversas etapas del proceso fermentativo. Se hicieron en total 62 comparaciones, fluctuando los Δ% en el 93,5% de las mismas,entre +- 17%. El balance resultó muy satisfactorio sobre todo si tenemos en cuenta que la desviación standard del método microbiológico es de alrededor de 15%. En este estudio comparativo, es muy importante la circunstancia de que la equivalencia de valores resultantes de ambos métodos, no se obtenga solo al final sino también a lo largo de las diversas etapas de la fermentación, lo que permite utilizar el método químicosin restricciones para determinar la curva de producción de vitamina B12, en presencia de intermediario de su síntesis biológicos. 4) Las variantes introducidas en el método espectrofotométrico, permiten salvar algunos inconvenientes que se presentaban al ser aplicado a la determinación de vitamina B12 en caldos de fermentación. a) En primer lugar, el estudio del tiempo de cianuración con 1% de CNK o CNN a permitió acortarle de 5 a 2 horas; se trató de eliminar esa etapa de cianuración pero un estudio comparativo sobre 9 caldos diferentes, demoestró que la recuperación de vitamina era entonces de 21,7% menor.(la cianuración convierte la B12 y variantes en su complejo dicianuro, que es la mejor forma de extraer la actividad del caldo por solventes, a pH de alrededor de 11,0.) b) El problema de emulsiones en las etapas extractivas, se trató de resolver con el uso de aniemulsionantes (Dupenol, Cuaternario) y también, haciendo un proceso de defecación (sulfato de aluminio, Sulfato de zinc o acetato de plomo) al caldo ya autolizado, pero ninguna de las dos variantes aportaron la solución buscada. En los ensayos de defecación, el sulfato de aluminio demostró ser útil en los niveles de 5 y 10% con una recuperación de vitamina de 95,5% con respecto al testigo, pero no presentó constancia en la eliminación del problema emulsiones. El acetato de zinc, por aparición de turbidez en las soluciones acuosas que deben leerse en espectrofotómetro y el acetato de plomo, por precipitación del cianuro y baja recuperación de B12, debieron ser desechados. Finalmente, una nueva técnica en la preparación de las muestras, permitió resolver favorablemente el problema, eliminando por centrifugación (1 hora a 2.000 r.p.m) las sustancias causantes de las emulsiones y autolizando las células, que contienen toda la vitamina en presencia de agua destilada. Además, esto permite obtener extractos acuosos finales de una pureza similar a los de vitamina B12 patrón y complejo dicianuro. c) El estudio de varios sistemas de solventes para agotar los caldos, permiten decir que si bien el alcohol bencílico es muy específico y sin duda el más aconsejable para extraer la vitamina, puede ser reemplazado por los sistemas: Butanol más 5% de una solución 90% de Fenol y butanol más 10% SO3Na2, obteniéndose en los dos casos resultados equivalentes en B12 y una curva de absorción espectrofotométrica de los extractos acuosos finales, perfectamente aceptabble. En ambos sistemas se agrega previamente a la extracción 20% de SO4Na2 (los ensayos cualitativos demostraron por el color de la fase solvente, que el selado es imprescindible para obtener buena recuperación de la vitamina presente en el caldo). 5) El estudio espectrofotométrico de mezclas de soluciones acuosas de CNK y B12 en diferentes concentraciones, permitió observar lo siguiente: a) Para valores de la relaciónƔ/ml CNK/Ɣ/ml B12 menores de 0, 46/1, se obtiene espectro de vitamina B12 con un máximo a 550 mμ y una meseta entre 520 y 530 mμ. b) Para valores entre 0,48/1 y 0,57/1, se obtienen espectros con un solo máximo a 540 mμ. c) Para valores entre 0,60/1 y 0,57/1, se obtienen espectros con dos máximos a 540 y 580 mμ, pero con la particularidad de que el segundo máximo es menor que el primero (a la inversa de lo que ocurre con el complejo dicianuro). d) Finalmente, para valores de la relación mayores a 1,75/1, se comienza a observar espectro característico de complejo dicianuro (dos máximos a 540 y 580 mμ, siendo el segundo máximo mayor que el primero). Es decir, que variando la relación Ɣ/ml CNK/Ɣ/ml B12 se pasa del espectro característico de B12 a una zona en que se obtiene espectros mezclados y finalmente, se llega al espectro del complejo dicianuro. Además, se demostró que es necesario un valor de la relación molar CNK/B12 del orden de 2.300/1, para transformar cuantitativamente B12 en complejo dicianuro. En el método espectrofotométrico se usa 1% de CNK para la etapa de cianuración, lo que representa para los niveles normales actuales de B12 en caldos un valor de la relación molar CNK/B12 del orden de 22.000/L o sea alrededor de 10 veces mayor que la necesaria para transformar cuantitativamente B12 en complejo dicianuro. En cambio, si se trabajo con 1% de CNNa, el valor de la relación molar CNNa/B12 para los niveles normales de B12 en caldos, es de 29.000/1 o sea, alrededor de 12,5 veces mayor que la necesaria para transformar cuantitativamente B12 en complejo dicianuro. El exceso de cianuro es necesario por ser la concentración de B12 en el caldo un incógnita. 6) Finalmente, se hizo un estudio estadístico comparativo de los métodos biológicos (leichuanii) y químico (espectrofotométro),sobre 18 caldos de fermentación en el momento de ser cosechados, haciendo cada determinación por cuadruplicado. El estudio estadístico da: Para el método microbiológico una línea promedio de 21,4 Ɣ/ml con una S% igual a 13,8 y para el método químico 21,7 Ɣ/ml con una S% de 1,88. Esto acuerda amplia ventaja al método espectrofotométrico pues a su menor coste, se suma la seguridad de poder obtener los resultados en el día con un solo operador. El método microbiológico, requiere por lo menos dos ensayos consecutivos con dos operadores y no brinda la seguridad de tener al tercer día los datos requeridos. 7) Con los datos obtenidos en los 18 caldos ensayados, se representaron gráficos de control (de promedios y de rangos), para métodos (biológicos y químicos). Estos gráficos nos permitieron observar lo siguiente: a) La concordancia de valores ya mencionados para la línea promedio general de ambos métodos: Biológicos: 21,4 Ɣ/mlquímico: 21,7 Ɣ/ml b) La diferencia de las desviaciones tipo % de ambos métodos se refleja en el gráfico de rangos, donde se observa que la línea de rango promedio para el método químico es de un valor 4,5 veces menor que para el método biológico. 8)El método propuesto en las siguientes etapas: a) Preparación de la muestra. Centrifugar 1 hora a 2.000 r.p.m 100 ml. de caldo perfectamente homogeneisado, en vaso de centrífuga de 250 ml. Separar cuidadosamente por succión el sobrenadante y desecharlo. Añadir el residuo celular 100 ml. de agua destilada y 1 ml. de solución 5% de CNK. Autolizar durante 30´ en B.M. a 100°C. Enfriar. Llevar a 200 ml. con agua destilada y centrifugar 30´ a 2.000 r.p.m. Separar el sobrenadante por decantación y utilizarlo en la terminación. b) Etapa de cianuración: Transformación de B12 y variantes en complejo dicianuro. 50 ml. de caldo preparado según se indica en a) más 0,5 g. de CNK o CNNa, se lleva a pH 9,7 con solución 50% de HONa y se deja 2 hs. a temperatura ambiente y luz difusa. c) Etapa de extracción de la actividad vitamínica del caldo. Añadir con agitación 10 g. de SO4Na2 y llevar a pH 11,3 con solución 50% de HONa. Extraer 3 veces con 5 ml. de alcohol bencílico cada vez, en tubo de 25 x 200 mm. con tapón de goma. Se puede reemplazar con 3 extracciones de 5 ml. de Butanol previo agregado de 10% P/V de SO3Na2 o 5% V/V de solución 90% de Fenol. Centrifugar luego de cada extracción, 5´ a 2.000 r.p.m. Reunir los extractos en tubo de vidrio de 25 x 120 mm. con tapa esmerilada. d) Pasaje a fase acuosa de la actividad extraída del caldo. Añadir 7,5 ml. de Consulte el resumen completo en el documento.
