Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | quimica |
| Título: | Uridina-difosfato-azúcares en bulbo de dalia |
| Autor: | González, Nélida Susana |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Fundación Instituto Leloir - CONICET. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires (IIBBA)
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| Publicación en la Web: | 2017-11-06 |
| Fecha de defensa: | 1963 |
| Fecha en portada: | 1963 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Químicas |
| Director: | Pontis, Horacio G. |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1184_Gonzalez |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n1184_Gonzalez.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n1184_Gonzalez |
| Ubicación: | Dep.001184 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. González, Nélida Susana. (1963). Uridina-difosfato-azúcares en bulbo de dalia. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1184_Gonzalez |
Resumen:
Durante el estudio de los nucleótidos presentes en bulbos de Dalia, se han logrado aislar UDP-glucosa y UDP-galactosa, acompañados de otro nucleótido-di-fosfato-azúcar que se identificó como UDP-fructosa. También se determinó la presencia de UDP-acetilglucosamina, conjuntamente con UDP-acetilgalactosamina en una mezcla similar a la descripta por Pontis en hígado. Si bien se han intentado varios métodos de purificación de los extractos alcohólicos de bulbo, se ha recurrido principalmente al uso de Dowex-l-acetato seguido de cromatografía en papel o de intercambio iónico en columna de Dowex-l-cloruro. El extracto alcohólico se pasó por una columna de Dowex-l-acetato y eluyó con una solución de cloruro de sodio 0.2 M - ácido clorhídrico 0.003 N. La fracción de los nucleótido-azúcares se adsorbió sobre carbón-celita, recuperándoselos como sales de sodio por elución con alcohol-50%. Estos eluatos se purificaron posteriormente por cromatografía en papel con los solventes de etanol-acetato de amonio neutro y acídico descriptos por Paladini y Leloir o por cromatografía de intercambio en columna de Dowex-l-cloruro utilizando gradientes de elución de cloruro de sodio a pH constante. De esta forma se obtuvieron dos fracciones que contenían principalmente UDP-glucosa y UDP-acetilglucosamina, respectivamente. Todas las fracciones de UDP-glucosa separadas en las distintas preparaciones y por los distintos métodos de aislamiento utilizados, liberaban sustancias reductoras al ser sometidas a hidrólisis durante 15 min. a 100°C en ácido clorhídrico 0.01N. La cromatografía en papel de estos productos de hidrólisis utilizando fenol-agua o butanol-piridina-agua como solventes permitió separar tres manchas revelables con nitrato de plata alcalino y cuyos Rribosa eran coincidentes con los de glucosa, galactosa y fructosa. Se obtuvieron idénticos resultados por electroforésis o cromatografía en butanol-piridina- agua, ambos sobre papel impregnado en tetraborato de potasio. La fructosa separada previamente por cromatografía en fenol-agua de los otros componente, se la identificó por el espectro característico del color desarrollado en presencia de resorcinol-ácido clorhídrico en la reacción de Roe. Además se reveló la presencia de fructosa por reducción con borohidruro de sodio, identificándose solamente sorbitol y manitol por cromatografía en papel impregnado con molibdato de amonio utilizando butanol-piridina-agua como solventes. El espectro de absorción en el ultravioleta de la fracción UDP-glucosa era indistinguible del de uridina y presentaba los mismos cambios con el pH. Los nucleótidos liberados por hidrólisis de 15 min. en ácido 0.01 N y de 30 min. en ácido 1 N a 100°C, se identificaron como UDP y UMP respectivamente, por cromatografía en papel utilizando los solventes de etanol-acetato de amonio neutro y acídico. Por tratamiento con la pirofosfatasa orgánica de veneno de serpiente se separaron dos fracciones: una con absorción en el ultravioleta formada por el nucleósido residual y otra que contenía los fosfatos orgánicos. La primera se indentificó, cromatográficamente en tres sistemas distintos de solventes y por electroforésis a pH 2, como uridina. Los ésteres fosfóricos liberados durante la hidrólisis enzimáticase estudiaron por electroforésis sobre papel impregnado con tetraborato de cetil-trimetilamonio, observándose tres manchas con reacción positiva de fosfato (Burrows) y cuyas movilidades eran similares a las de glucosa-l-fosfato, galactosa-l-fosfato y fructosa-l-fosfato. La cromatografía en isopropanol-amoníaco-agua de la fracción UDP-glucosa, permitió obtener UMP y los ésteres cíclicos. Estos últimos se aislaron e hidrolizaron durante 30 min. a 100 °C en ácido clorhídrico 1 N. cromatografiándose en papel impregnado con tetraborato de potasio 0.01 M usando butanol-piridina-agua como solvente. Se identificaron tres manchas reductoras con Rrib de glucosa, galactosa y fructosa. El estudio analítico de esta fracción permitió determinar la presencia de dos grupos fosfato por molécula de base, siendo uno de ellos liberable como fosfato inorgánico durante una hidrólisis de 15 min. a 100 °C con ácido clorhídrico 1N. Además, por hidrólisis suave se liberaba una molécula de azúcar reductor por molécula de uridina. La incubación con UDP-glucosa dehidrogenasa de hígado de la fracción de UDP-glucosa, permitió confirmar la presencia en la mezcla de un compuesto con fructosa. El UDP-ácido glucorónico formado por acción de la enzima sobre el UDP-glucosa se separó del resto de la mezcla por cromatografía en columna de Dowex-l-formiato que se eluyó con gradiente lineal de formiato de amonio. Posteriormente se determinó en la mezcla residual la relación de los tres azúcares liberados en la hidrólisis acida y separados convenientemente por cromatografía de papel. Los valores obtenidos indican que la fructosa comprendía el 9.4% de la mezcla oxidada, mientras que en la mezcla original el porcentaje era del 3.4%. El hecho de que el nucleótido de fructosa se comporte en forma idéntica al UDP-glucosa o UDP-galactosa en cromatografía de papel o de columna de intercambio, indica que estas sustancias están estructuralmente muy relacionadas. Además, libera UDP y UMP en las mismas condiciones de acidez que el UDP-glucosa, por lo que se puede deducir que la unión entre la uridina y la fructosa es a través de un grupo 5´-pirofosfato. Este tipo de unión está corroborado por la acción del veneno de serpiente que conduce a la formación de una mezcla ésteres fosfóricos y de uridina, por acción de la 5´-nucleotidasa, también presente en el extracto enzimático, sobre el nucleótido-monofosfato producido en la hidrólisis del puente pirofosfato. Estos datos, sin embargo, no permiten determinar cuál es el C de la fructosa a través del cual se une al nucleótido difosfato. No obstante, una apreciación visual de los cromatogramas indica que la velocidad de liberación de la fructosa es similar a la de la glucosa y galactosa. La velocidad de hidrólisis en medio ácido diluído del UDP-fructosa sintético preparado a partir de UMP-5´-morfolidato y de fructosa-l-fosfato es mucho menor que la de glucosa a partir de UDP-glucosa. Esto indicaría que en el nucleótido natural, la fructosa no está unida a través del C-1, sino a través de una unión más lábil probablemente involucrando al C-2. La presencia de UDP-fructosa en tubérculos de Dalia es interesante, ya que lo señala como posible intermediario en la biosíntesis de fructosanos. La fracción de UDP-acetilglucosamina se determinó que libera por hidrólisis ácida suave sustancias que dan la reacción de Morgan-Elson para acetilhexosaminas y que migran como acetilglucosamina y acetilgalactosamina en cromatografía de papel impregnado con borato de potasio, utilizando butanol-piridina-agua como solvente. La sustancia con la misma movilidad que la acetilgalactosamina sometida a una hidrólisis ácida que lleva a su completa desacetilación se comporta como galactosamina en cromatografía de papel con butanol-piridina-agua. Además, por oxidación con ninhidrina de esta hexosamina, se determinó la formación de la correspondiente pentosa: lixosa, de acuerdo a su movilidad en butanol-piridina-agua. Por hidrólisis ácida en clorhídrico 0.01 N y 1 N se observó la formación de UDP y UMP respectivamente, de acuerdo a su comportamiento en cromatografía de papel con los solventes neutro y acídico de etanol-acetato de amonio. Estas observaciones indican que en bulbo de Dalia se encuentra presente una mezcla de UDP-acetilglucosamina y UDP-acetilgalactosamina similar a la aislada en hígado y que no habría sido deterctada aún en vegetales superiores. Además, en tan solo una de las preparaciones, se logró aislar por cromatografía, en el solvente neutro de etanol-acetato de amonio, una fracción que migraba como GDP-manosa. Su espectro era indistinguible del de guanosina y presentaba los mismos cambios con el pH. Se encontraron dos grupos fosfato por molécula de base, uno de ellos liberable en ácido clorhídrico 1 N durante 20 min. a 100 °C. Por hidrólisis suave a pH 2 durante 15 min. a 100 °C, se comprobó la liberación de tres azúcares reductores cuyos Rribosa en fenol-agua eran coincidentes con los de glucosa, manosa y fructosa. Si bien la cantidad disponible no permitió efectuar un estudio más detallado de esta fracción, los datos experimentales obtenidos señalarían la presencia en tubérculos de Dalia de una mezcla de nucleótidos de guanosina semejante a la encontrada por Pontis et al. en el hongo Eremothecium Ashbyii.
Citación:
---------- APA ----------
González, Nélida Susana. (1963). Uridina-difosfato-azúcares en bulbo de dalia. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1184_Gonzalez
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González, Nélida Susana. "Uridina-difosfato-azúcares en bulbo de dalia". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1963.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1184_Gonzalez
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