Resumen:
Es bien conocido que la presencia de bacteriófagos puede afectar las fermentaciones lacticas causando lalisis de las cepas de lactococos utilizadas como starters y ocasionando perdidas significativas en la producciónde quesos y otros productos lácteos. Los principales objetivos del presente trabajo fueron la caracterización de los bacteriófagos de cabezaalargada, aislados en Argentina (fagos ARG)y el desarrollo de un sistena modelo para el estudio de la resistenciaa fagos liticos (Lpr), encontrada en las mutantes espontáneas aisladas como resistentes a fagos ARG,además de la implenentación de estrategias conjugativas para la transferencia de Lpr a otras cepas de L. lactis,con el propósito de construir cepas resistentes a fago, de utilidad tecnológica. Por otra parte, se enfocaronestudios comparativos de los fagos ARG en relación a un núlero de fagos aislados en USA (US) y sus correspondientescepas de propagación, utilizadas como starters por la industria láctea de ese pais. Adicionallente, sedispuso la determinación de la resistencia a antimicrobianos para las cepas del sistema modelo investigando suposible localización cromosomal o ligada a plásmidos y comparando el patrón de resistencia obtenido con el dedos cepas representativas de L. lactis gue suelen utilizarse como starters. Tambien se encararon estudios sobreel efecto del cloro cono agente de control y sobre la inactivación térmica de los fagos ARG y DS determinandolos tiempos de reducción decinal a 70°C (valores D70)a traves de distintas metodologias. Los fagos ARG y DS fueron aislados a partir de sueros de queso de Plantas lácteas de Argentina y USA, y suscorrespondientes cepas huésped de L. lactis provinieron de starters comerciales tambien utilizados en la industria,excepto L. lactis ssp. lactis C2, cepa de propagación de los fagos ARG, originalmente procedente dellaboratorio del Dr. L. McKay. Iniciallente, se verificaron las claves bioquilicas del genero, especie y subespeciepara estas cepas, anteriorlente denominadas Streptococcus lactis y Streptococcus cremoris las que, segunlo confirmado de acuerdo con la nueva taxonomía, corresponden a Lactococcus lactis ssp. lactis y ssp. cremoris,respectivalente. Los fagos ARG, únicos fagos de L. lactis descritos en Argentina, resultaron ser fagos de remarcable poderlitico y de morfología alargada, en contraposición con la mayoria de los fagos de USA y de otros paises.predominantenente isométricos, lo que motiva que el estudio de estos fagos ARG y la resistencia a los misnos, setorne de particular interés. Desde el punto de vista serológico los fagos ARG pudieron incluirse en uno de losdos grupos serológicos en que han sido clasificados los fagos US. El priner grupo, denominado D59-l/F4-l, en elcual fueron incluidos los fagos ARG, es compartido tanto por fagos de morfologia alargada, como isométrica. Ademas, se observó una marcada homología antigénica entre los fagos ARG y el fago US D59-1, indicando unestrecho grado de relación a pesar de su distinto origen y región geografica. Los estudios sobre inactivacióntermica en leche revelaron valores D70 entre 20 y 38 min, resultando notablemente mas altos que los obtenidos encaldo M17, los que apenas superaron los 10 min. Se verificó además, la inusual resistencia térmica del fago US F29-1, marcadamente superior a los valores mencionados. El efecto protector de la leche tambien se evidenció enlos tratamientos con hipoclorito de sodio necesitándose una concentración de 2000 ppm durante 3 min para reduciren 6 log la población inicial, en tanto que en caldo M17 fueron necesarias sólo 300 ppm para inactivar la mismapoblación en iguales condiciones. Los valores de inactivación han demostrado que las condiciones de higiene ypastenrización en la industria láctea no siempre resultan suficientes para inactivar la totalidad de los fagos eimpedlr su proliferación en el ambiente de la Planta. Por otro lado, se deterninaron los tienpos de muertetérmica mediante dos metodologías distintas. A través de la técnica de Daoust modificada, denoninada metodologia 2, se obtuvo una relación lineal entre los tiempos de tratamiento y la destrucción de los fagos, mientrasque las misnas graficas obtenidas por la metodologia l, en tubos pequeños sellados, presentaron una típicadesviación de la linealidad, frecuentemente bifasica, que es usualleute observada. Esta desviación puede serexplicada en función del fenómeno de agregación que se observa en las suspensiones de fagos inactivados por lametodologia l, aunque no se detectó para las suspensiones de fagos inactivadas por la metodologia 2. No obstantelos valores D obtenidos por ambas técnicas presentan una buena correlación (r2 = 0,99), si el valor D esestilado a partir de la primera fase de las curvas. También fueron aisladas mutantes resistentes a fago a partir L. lactis ssp. lactis C2, cepa de propagaciónde los fagos ARG. La resistencia encontrada resultó estable incluso durante largos periodos de subcultivo y dealmacenamiento. Por otra parte, propiedades tecnológicas apreciadas, como la coagulación rapida de la leche a 22°C se mautuvieron intactas en las mutantes. Cuando estas cepas fueron enfrentadas a 13 fagos US de distintogrupo morfológico y serológico se observó que las mutantes de C2 resultaban resistentes a los fagos isométricos,tal como podía esperarse ya que la cepa original C2 también lo era, pero también resultaron resistentes a otrosfagos US de cabeza alargada indicando que se estaba en presencia de un mecanismo de resistencia particularmenteefectivo contra fagos de este grupo morfológico. Los datos de los parámetros de multiplicación de los fagos ARGobtenidos sobre las mutantes, demostraron que la resistencia detectada se trataba de un mecanismo de interferenciaen la adsorción del fago a la célula. Además se llevaron a cabo ensayos adicionales para descartar laexistencia de un estado lisogenico, o la posible presencia de algún mecanismo sensible al calor o de modificacion-restricción controlado por el huésped, teniendo en cuenta que algún otro mecanismo de defensa contra fagosalargados pudiera encontrarse activo en estas cepas. Los perfiles de plasmidos de la cepa C2 y de las mutantes resultaron iguales salvo para una de ellas, noviéndose afectada en ningún caso la expresión de Lpr+. El curado sucesivo de los plasmidos de las mutantestampoco afectó la resistencia a fago, pareciendo indicar una localización cromosomal para Lpr. Con la intenciónde determinar si el marcador Lpr resultaba movilizado por conjugación se utilizó la cepa LM2302, un derivadolibre de plásmidos de C2 con dos marcadores antibióticos, para efectuar cruces con las mutantes quedando constituídoun sistema que junto con los fagos ARG, permitió conocer las acerca del mecauismo de resistencia encontrado. Se diseño entonces un sistema modelo para el estudio de la resistencia a fagos ARG utilizando la cepaoriginal C2 (Lpr-) y sus mutantes (Lpr+) C23 y C26, asi como la cepa LM2302 derivada libre de plásmidos de C2. Las experiencias de transconjugación mostraron que si bien el curado de plásmidos no afectaba la expresión de Lpr+, este caracter podia ser co-trausferido por conjugación en un pláslido de 45 kb que codifica la capacidadde fermentar lactosa (Lac+). Para completar el sistema modelo se incorporaron dos transconjugantes representativosde estos cruces eligiéudose a TC26-B por tener el contenido de plásmidos completo, y a TC23-B porque poseecomo único plásmido el de lactosa (Lac+) de 45 kb, que además codifica la resistencia a fagos liticos alargadas.los resultados sugieren la posibilidad de que la secuencia de DNA que codifica Lpr estuviera inicialmenteintegrada al cromosoma y, que por reacomodamientos del DNA durante la conjugación, resultara incorporada enforma especifica al plásnido de 45 kb. También es posible que se trate de una transposición de un segmento de DNA que pudiera encontrarse alternativasente en el plásmido de 45 kb o en el cromosoma. Por otro lado, se logró extender el fenotipo Lpr+ por conjugación a otras cepas no isogenicas. Para ello,la cepa TC23-B fue elegida como portadora del plásmido de 45 kb denominado pTC23-B (Lac+ Lpr+) y fue utilizadacomo dadora del mismo en subsecuentes transferencias por conjugación a otras dos cepas no isogénicas de L.lactis ssp. lactis y ssp. cremoris, representativas de starters utilizados en USA. A este fin, se desarrolló unaestrategia de conjugación eludiendo la utilización de marcadores antibióticos para la selección. De esta formase logró transferir el pTC23-B a cepas de ssp. lactis y ssp. cremoris curadas de su plásmido de lactosa (Lac-)restituyéndoles el fenotipo Lac+ propio de TC23-B y confiriéndoles resistencia a fago a cepas no portadoras demarcadores de resistencia a antibióticos gue resultan aptas para su uso alimentario y de gran utilidad tecnologica. Adicionalmente, se estudio la sensibilidad a antimicrobianos en las cepas del sistema modelo, mutantes ytransconjugantes, para investigar silas resistencias halladas eran cromosomales o estaban detersinadas por plásmidos. Además se comparó el patrón de resistencia obtenido, con el de las dos cepas no lisogénicas representativas de los starters, ssp. lactis 37-1 yla ssp. cremoris 59-1. Las cepas tanto de la ssp. lactis como de la ssp. cremoris se mostraron sensibles a lamayoria de los 36 antibióticos ensayados. Esto, resulta esperable, en función de su escaso contacto conantimicrobianos, a diferencia de las cepas de origen clinico, sonetidas a presión selectiva por antibióticos. Ent Consulte el resumen completo en el documento.
Citación:
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Valladares de Fabrizio, Susana Marta. (1992). Sistema modelo para el estudio de resistencia a bacteriófagos de Lactococcus lactis aislados en Argentina. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2549_ValladaresdeFabrizio
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Valladares de Fabrizio, Susana Marta. "Sistema modelo para el estudio de resistencia a bacteriófagos de Lactococcus lactis aislados en Argentina". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1992.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2549_ValladaresdeFabrizio
