Resumen:
En este trabajo se presenta un estudio de la biosíntesis de los exopolisacáridoscomplejos producidos por tres especies de bacterias Gram negativas, Rhizobiumleguminosarum (R.l.), Rhizobium meliloti (R.m.) y Acetobacter xylinum (A.x.). Con el sistema de R. l. se utilizaron las siguientes cepas: R. l. bv. phaseoli 8002 esuna cepa silvestre que sintetiza exopolisacárido (EPS+) y tiene capacidad paranodular (Nod+) y fijar nitrógeno (Fix+) en las raíces de su planta hospedadora,poroto (Phaseolus vulgaris). Dicha capacidad se encuentra codificada en un plásmidosimbionte llamado pRP2JI. A la cepa 8002 curada de su plásmido simbionte se ladenomina R.l. 8401, que no puede nodular ni fijar nitrógeno en poroto (Nod-, Fix-),pero produce exopolisacárido en cantidades equivalentes a la de su contrapartesilvestre (EPS+). Una cepa derivada de la 8401 es la cepa R. l. bv. viciae 8401 pRL1JI,que es la cepa 8401 a la cual se le ha introducido el plásmido simbionte (pRL1JI) deotra cepa silvestre llamada R. l. bv. viciae 248 que nodula y fija nitrógeno en arveja (Vicia hirsuta) (Nod+, Fix+) y produce un exopolisacárido de estructura diferente a lacepa 8002 (EPS+). La cepa 8401 pRL1JI es Nod+ y Fix+ en arvejas y produce unexopolisacárido de estructura idéntica al de la cepa 8002 (EPS+). Otra cepa EPS+utilizada fue R. l. bv. trifolii NA-30, que tiene capacidad para nodular y fijar nitrógeno (Nod+, Fix+) en trébol (Trifolium repens) y también sintetiza un exopolisacárido deestructura idéntica al de la cepa 8002. La estructura propuesta para la unidadrepetitiva del exopolisacárido producido por las cepas 8002, 8401, 8401 pRL1JI y NA-30,es la siguiente: (ver diagrama en la tesis). Además se utilizó una mutante defectiva en la síntesis del exopolisacárido (EPS-), obtenida por mutagénesis con el transposón Tn5 con la cepa silvestre R. l. bv.phaseoli 8002, llamada R. l. bv. phaseoli RW4 pero que sin embargo es Nod+ y Fix+,en porotos. Se realizaron incubaciones in vitro con preparados enzimáticos las distintascepas (células tratadas con EDTA) en presencia tanto de UDP[14C]Glc como UDP[14C]GlcA y se estudió la transferencia de radioactividad a diferentes fracciones,principalmente Extracto 1203 (extracción con solvente orgánico) y sobrenadante deincubación. Se utilizaron diferentes técnicas analíticas para el estudio de loscompuestos presentes en las diferentes fracciones; electroforesis en papel,cromatografía, filtración por geles, perrnetilación, etc. En trabajos anteriores realizados en nuestro laboratorio con la cepa R. l. bv.trifolii NA-30, se pudo observar al analizar los Extractos 1203 que se formabandiferentes lípido-azúcares con las características de un prenol-PP-trisacárido, con laestructura de los primeros tres restos glicosídicos de la unidad repetitiva, GlcAβ(1-4) GlcAβ(1-4)Glc (comenzando por el extremo reductor) que podía estar O-acetilada ono, y un prenol-PP-octasacárido, con la estructura de la unidad repetitiva (octasacáridodipiruvilado y acetilado) correspondiente al exopolisacárido descripto para esta cepa. En este estudio previo no se logró polimerización de la unidad repetitiva in vitro quediera como producto final el exopolisacárido (EPS) (J.C. Bossio, 1989, Tesis Doctoral). En el presente trabajo, al analizar el Extracto 1203 se pudieron aislar, pordiferentes técnicas de incubación, todos los intermediarios de biosíntesis a nivel delípido-azúcares, en las fracciones de extracción orgánica (tanto con marca en [14C]Glccomo en [14C]GlcA), desde el prenol-PP-glucosa hasta el prenol-PP-octasacáridodipiruvilado (unidad repetitiva) y se demostró que los mecanismos de biosíntesis del EPS y sus intermediarios eran análogos en todas las cepas estudiadas (8002, 8401, 8401pR1JI y NA-30). Además, y muy importante, al analizar los sobrenadantes deincubación se observó que se pudo obtener polimerización in vitro de la unidadrepetitiva que dió como producto final el polisacárido (EPS), en todos los casos. También se demostró de manera inequívoca, a través de incubaciones en dos etapas,que los intermediarios lípido-azúcares intervienen de manera directa en la síntesis del EPS en todas las cepas estudiadas. Esta es la primera vez que se describepolimerización in vitro de un exopolisacárido producido por bacterias del género Rhizobium. Todas estas cepas también produjeron in vitro un glucano β(1-2) (que estascepas sintetizan) que no se estudió en mayor detalle. Por otra parte, se estudió latransferencia de restos acetilos, en incubaciones llevadas a cabo en presencia de [14C]acetil-CoA, y se vió que el grupo O-acetilo se incorporaba tanto a nivel deintermediarios lípido-azúcares como de polímero (EPS). Al utilizar la cepa mutante RW4 con este tipo de preparado enzimático (células tratadas con EDTA) no sepudieron obtener buenas incorporaciones de radioactividad al Extracto 1203. En una segunda parte de este trabajo, se realizó con la utilización de un nuevopreparado enzimático (células electroporadas) que resultó extremadamente útil parala caracterización de cepa mutante defectiva en la síntesis de EPS, Rhizobiumleguminosarum bv. phaseoli RW4 y para el estudio de biosíntesis in vitro de EPS encepas en las cuales no había sido posible obtener polimerización in vitro, como en Rhizobium meliloti y Acetobacter xylinum. Con respecto a la cepa RW4 (EPS-), se la caracterizó bioquímicamente y seobservó que era capaz de sintetizar la unidad repetitiva a nivel de intermediario lípido-azúcar, aunque en menos cantidad que su contraparte silvestre (la cepa 8002), pero no produjo EPS in vitro. También produjo in vitro Glucanosβ(1-2). El sistema de Rhizobium meliloti fue el segundo en ser utilizado con estesistema de células electroporadas para el estudio in vitro de la síntesis de unexopolisacárido, el succinoglicano. Esta especie se caracteriza por tener la capacidadde nodular y fijar nitrógeno (Nod+, Fix+) en alfalfa (Medicago saliva). Se trabajótanto con la cepa silvestre Rm 1021 (EPS+) como con la mutante defectiva en lasíntesis (EPS-), la cepa Rm 7094 (exo B-), que es además Nod- y Fix-. La unidadrepetitiva descripta del siccinoglicano es la siguiente: (ver diagrama en la tesis). Estudios previos realizados por otro investigadores han demostrado que enincubaciones in vitro en presencia de UDP[14C]Glc y células tratadas con EDTA seobtuvieron en los extractos orgánicos, compuestos con las propiedades de lípido-azúcares,que comprenderían desde el prenol-PP-Gal (primer resto glicosídico) hastael prenol-PP-unidad repetitiva (prenol-PP-octasacárido), pero no se logró obtener elproducto final, succinoglicano. En este trabajo al usar la cepa silvestre 1021, se pudo observar que enincubaciones realizadas en presencia de UDP[14C]Glc, tanto con células tratadas con EDTA, como con células electroporadas, se obtuvieron buenas incorporaciones deradioactividad a nivel de los lípido-azúcares (Extracto 1203), pero en mayor cantidadcon el sistema de células electroporadas (más del 100%). En ambos casos se observóformación de lípido-azúcares, caracterizados como el prenol-PP-octasacárido (prenol-PP- Octa) y su derivado substituído (acetilado y piruvilado) (prenol-PP-Octa.A.). Sóloen el caso de utilizar células electroporadas se observó formación de polímero in vitro. Se estudió la estructura del Octa y del polímero (succinoglicano) obtenidos in vitro y sedemostró que ambos tenían la estructura esperada, siendo la primera vez que sedescribe formación de succinoglucano in vitro en Rhizobium meliloti. La confirmaciónde estos estudios se obtuvieron al utilizar la cepa Rm 7094 (exo B-) en ensayos de complementación in vitro, en donde al agregar UDP[14C]Glc en presencia de UDP-Gal,no sólo se obtuvieron lípido-azúcares, sino que se logró obtener polimerización invitro. También se pudieron sintetizar in vitro otros polisacáridos de bajo pesomolecular compuestos por 1, 3 y 4 unidades repetitivas (Octa, Octa3 y Octa4,respectivamente), previamante descriptos in vivo por otros investigadores. Ensayos de incubación en dos etapas con la cepa Rm 7094, demostraronclaramente que el prenil-difosfato-Octa.A. intervendría como intermediario en lasíntesis del succinoglicano final y además del Octa.A., Octa 3 y Octa 4 libres. Por último, se utilizó la cepa silvestre de Acetobacter xylinum RC Grl, quesintetiza un exopolisacárido llamado acetano cuya unidad repetitiva es unheptasacárido con la siguiente estructura: (ver diagrama en la tesis). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, con células tratadas con EDTA de Acetobacter xylinum como preparado enzimático, han demostrado la síntesissecuencial in vitro de la unidad repetitiva a nivel de compuestos lípido-azúcares (prenol-PP-heptasacárido), pero no se pudo obtener tampoco en este casopolimerización in vitro de la unidad repetitiva, para dar acetano. Se hizo un estudio detallado de la puesta a punto de la técnica deelectroporación de células en el sistema de Acetobacter xylinum; se estudiarondiferentes variables como el efecto del voltaje (Voltios), capacitancia (Faradios),resistencia (Ohms), tiempo de permeabilidad, ayuno de las células, temperatura deincubación, etc. En este estudio, al analizar los resultados, se observó que al usar célulaselectroporadas se obtuvo síntesis in vitro tanto de polímero (acetano) como deintermediarios de biosíntesis (prenol-difosfato-heptasacárido) a partir de todos losdadores de restos glicosídicos radioactivos (UDPGlc, UDPGlcA, GDPMan y TDPRam) y no glicosídicos, como acetil-CoA, demostrando que los compuestosra Consulte el resumen completo en el documento.
Citación:
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Semino, Carlos Eduardo. (1994). Biosíntesis y estructura de exopolisacáridos complejos de Rhizobium leguminosarum, Rhizobium meliloti y Acetobacter xilinum. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2627_Semino
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Semino, Carlos Eduardo. "Biosíntesis y estructura de exopolisacáridos complejos de Rhizobium leguminosarum, Rhizobium meliloti y Acetobacter xilinum". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1994.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2627_Semino
