Registro:
Documento: | Tesis Doctoral |
Disciplina: | biologia |
Título: | Especificidad tisular de la expresión de genes Eucariotas en ratones transgénicos : 1) 3,8 kilobases del promotor de beta-caseína bovino dirigen la expresión de proteínas recombinantes a la glándula mamaria y 2) expresión específica del gen de proopiomelanocortina en el sistema nervioso central |
Título alternativo: | Tissue specific expression of eucaryotic genes in transgenic mice: 1) 3.8 kilobases of the bovine beta-casein gene direct the expression of recombinant proteins to mammary gland and 2) Tissue-specific expression of the pro-opiomelanocortin gene in the Central Nervous System |
Autor: | Cerdán, Marcelo Guido |
Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
Filiación: | Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI)
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Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
Fecha de defensa: | 1999 |
Fecha en portada: | 1999 |
Grado Obtenido: | Doctorado |
Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
Director: | Rubinstein, Marcelo |
Idioma: | Español |
Tema: | biología/biología molecular y celular biología/ingeniería genética
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Formato: | PDF |
Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3150_Cerdan |
PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3150_Cerdan.pdf |
Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3150_Cerdan |
Ubicación: | Dep.BIO 003150 |
Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Cerdán, Marcelo Guido. (1999). Especificidad tisular de la expresión de genes Eucariotas en ratones transgénicos : 1) 3,8 kilobases del promotor de beta-caseína bovino dirigen la expresión de proteínas recombinantes a la glándula mamaria y 2) expresión específica del gen de proopiomelanocortina en el sistema nervioso central. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3150_Cerdan |
Resumen:
Durante este trabajo se estudio la regulación tejido especifica de dos genes mediante la utilización de ratonestransgénicos. l) Se estudio con que eficacia un fragmento de 3,8 kb del promotor bovino de β-caseina puede dirigir una expresióntejido especifica a la glándula mamaria. El patrón de expresión espacial, temporal y hormonal del gen de fusión,resultó altamente regulado y confinado estrictamente a celulas epiteliales de la glándula mamaria lactante. Enestudios previos realizados sobre una línea celualar de glándula mamaria de ratón, se había demostrado que con 1,7kb del promotor bovino de β-caseína era posible obtener expresión celular específica, a su vez reguladahormonalmente. Esta misma construcción no funcionó al intentar dirigir la expresión específica a glándula mamariade ratones transgénicos. En este trabajo utilizamos un promotor de mayor tamaño del mismo gen, 3.8 kb, paradireccionar la expresión del gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) a glándula mamaria de ratonestransgénicos. Por medio de un ensayo de Northern blot se determinó la presencia de ARNm de hGH únicamente englándula mamaria de hembras en período de lactancia. Este ARNm no se detectó en glándula mamaria de hembrasvírgenes. Un análisis durante el desarrollo de la glándula mamaria demostró que el transgén sigue un patrón deexpresión que se asemeja mucho más al bovino que al murino. En estudios de hibridización in situ, realizados sobresecciones de glándula mamaria, se observó que el patrón de expresión del transgén resultó homogeneo en todos loslóbulos, tanto en animales heterocigotas como homocigotas. La cantidad de granos de plata contados sobre tejidomamario se correlacionó áltamente con el contenido de hGH en leche, previamente determinado porradioinmunoensayo (r=0 996). Por lo tanto, las 3,8 kb del promotor bovino de β-caseína pueden direccionar altosniveles de expresión de proteínas terapéuticas a la glándula mamaria de ratones transgénicos con especificidadcelular y regulación correcta durante el desarrollo. 2) Se evaluó la expresión celular especifica del gen de Pro-Opiomelanocortin (POMC) en neuronas. El gen de POMC se expresa en una serie de neuronas del hipotálamo y tracto solitario, y en corticotrofos y melanotrofoshipofisarios. En estudios previos se determinó que una porción proximal del promotor de POMC de rata o ratón erasuficiente para dirigir expresión celula-específica, regulada hormonalmente y en forma correcta durante eldesarrollo, a melenotrofos y corticotrofos, pero no a neuronas. Más recientemente se identificó la presencia deposibles activadores de la transcripción dentro de una zona de 11 kb en la región 5’flanqueante del gen de POMC (entre —13kb y —2kb). En el presente trabajo, por medio de un análisis delecional se ubicó el elemento neuronalespecífico a una resolución de 4 kb. Se generaron 3 construcciones conteniendo secuencias genómicas de POMC (6kb de la unidad transcripcional y 2 kb de la región 3’flanqueante) con diferentes longitudes de la región 5’flanqueante, 13 kb (-13/+8POMC-EGFP), 9 kb (—9/+8POMC-EGFP) y 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). A estassecuencias se les introdujo en el exón 2, previo al sitio ATG, una versión mamiferizada de la proteína verdefluorescente de medusa (EGFP). Esta innovación permitió visualizar la expresión transgénica en el cerebro ehipófisis en forma inmediata luego de realizar los cortes de los tejidos. En tres de un total de cuatro lineas deanimales transgénicos generados para las construcciones -5/+8POMC-EGFP y -9/+8POMC-EGFP se observófluorescencia en corticotropos y melanotropos. Estos transgenes se expresaron en neuronas. Contrariamente, laconstruccion -13/+8POMC-EGFP se expresó correctamente en hipófisis y neuronas de POMC Este resultado nossugiere que la presencia del elemento neuronal específico buscado se encuentra entre —9 y —l3kb del inicio de latranscripción. En experimentos futuros, nuestro objetivo será clonar e identificar el factor de transcripción neuronalque interactúa con los elementos en cis. Nosotros proponemos inmortalizar un linea celular neuronal que exprese POMC mediante oncogénesis dirigida en ratones transgénicos. Hemos generado 4 lienas de ratones transgénicoscon una construcción similar a —l3/+8POMC-EGFP, pero conteniendo una versión termo-sensible del antígeno Tlargo (AgT-tsA58) insertada en el segundo exón del gen de POMC de ratón. En estas 4 líneas se desarrollarontumores prematuramente en la región hipofisaria-lúpotalámica, a pesar de que la temperatura corporal del ratón esno permisiva. Tres de estos ratones murieron antes de reporoducirse. Sólo una líena pudo ser mantenida con unprograma de aparcamientos utilizando machos jóvenes. En estudio realizado con un Northern blot se observó unaexpresión considerable de POMC en esos tumores. En próximos experimentos evaluaremos la prsencia demarcadores neuronales e hipofisafios para determinar la naturaleza de dichos tumores.
Abstract:
During this study the tissue specific regulation of two different promoter genes were studied using transgenic mice. 1) The ability of a 3.8-kilobase promoter of the bovine β-casein gene to drive cell specific expression to themammary gland was evaluated in transgenic mice. The spatial, temporal, and hormonal pattern of expression of thefusion gene is highly regulated and confined to the epithelial cells of the lactating mammary gland. Previous studieshave shown that l.7 kb of the bovine β-casein promoter were able to drive cell-specific and hormone-dependentexpression in a mouse mammary cell line but failed to induce accurate expression to the mammary gland oftransgenic mice. We investigated here the ability of a larger sequence consisting of 3.8 kb of the bovine β-caseingene promoter to drive the expression of the human growth hormone (hGH) gene in transgenic mice. A Northernblot analysis using total RNA obtained from different tissues of lactating and non lactating females revealed thepresence of hGH mRNA only in the mammary gland of lactating females. hGH mRNA was not detectable in themammary gland of Virgin females. A developmental analysis showed that hGH mRNA only peaked on parturition,resembling more closely the bovine β-casein temporal expression pattern rather than the murine. In situhybridization studies performed on mammary gland sections showed that the cellular pattern of hGH expression washomogeneous in all lobules from heterozygous and homozygous transgenic mice. Silver grain counts on the tissuesections highly correlated with the hGH contents in the milk determined by radio immunoassay (r = 0.996). Thus 3.8kb of the bovine β-casein promoter direct a high-level expression of therapeutic genes to the lactating mammarygland of transgenic mice in a tissue-specific and developmentally regulated manner. 2) The cell-specific expression of the Pro-Opiomelanocortin (POMC) gene in hypothalamic neurons was evaluatedin transgenic mice. The POMC gene is expressed in a subset of hypothalamic and hindbrain neurons and in pituitarymelanotrophs and conicotrophs. Previous studies demonstrated that the presence of a proximal promoter of the rat ormouse POMC gene was sufficient to drive cell-specific, developmentally and hormonally regulated expression inmelanotrophs and conicotrophs of transgenic mice, but not in neurons. More recently we identified the presence of aputative neuron-specific enhancer/s within 11 kb of 5‘flanking sequences of the mouse POMC gene (-l3 kb to —2kb). In the present work, by using a deletional analysis in transgenic mice we localised this site/s within a 4 kbresolution. Three different constructs were generated containing genomic sequences of the POMC gene (6 kb of thetranscription unit and 2 kb of the 3’flanking region) with different lengths of the 5’flanking region, 13 kb (-13/+ 8POMC-EGFP), 9 kb (-9/+8POMC-EGFP) and 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). We also introduced in the exon 2 ofthe POMC gene, previous to the ATG site, a “mammalianized” version of the green fluorescent protein (EGFP). This innovation allowed us to visualise transgenic expression in the brain and the pituitary immediately after tissuesectioning. Three out of four lines of transgenic mice generated with each of the constructs, -9/+8POMC-EGFP and -5/+8POMC-EGFP showed green fluorescence in pituitary melanotrophs and conicotrophs. These transgenes failedto direct expression of EGFP to POMC neurons. However, the construct —l3/+8POMC-EGFP showed correctexpression in pituitary and hypothalamic neurons, suggesting that a specific neurone element is located between -9kb and —l3 kb from the transcription initiation point. In future experiments our goal is to clone and identify theneuronal transcription factor that interacts with the cis-acting elements. We propose to immortalise neuronal celllines expressing POMC by targeted oncogenesis in transgenic mice. We have generated 4 transgenic mouse lineswith a construct similar to the —l3/+8POMC-EGFP, but containing the temperature sensitive version of theoncogenic large T antigen (tsA58-Tag) inserted into the second exon of the mouse POMC gene. These four linesshowed premature tumors in the pituitary-hypothalamic region despite the non-permissive temperature of the mousebody. Three of these mice died before breeding. Only one line could be maintained by mating young males. Interestingly, Northern blots experiments showed high POMC expression in these tumors. In further experiments weare going to evaluate the presence of neuronal and pituitary markers to establish the nature of these tumors.
Citación:
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Cerdán, Marcelo Guido. (1999). Especificidad tisular de la expresión de genes Eucariotas en ratones transgénicos : 1) 3,8 kilobases del promotor de beta-caseína bovino dirigen la expresión de proteínas recombinantes a la glándula mamaria y 2) expresión específica del gen de proopiomelanocortina en el sistema nervioso central. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3150_Cerdan
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Cerdán, Marcelo Guido. "Especificidad tisular de la expresión de genes Eucariotas en ratones transgénicos : 1) 3,8 kilobases del promotor de beta-caseína bovino dirigen la expresión de proteínas recombinantes a la glándula mamaria y 2) expresión específica del gen de proopiomelanocortina en el sistema nervioso central". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1999.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3150_Cerdan
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