Estudio inmunohistológico y electrofisiológico de la motoneurona en un modelo de transmisión pasiva de Esclerosis Lateral Amiotrófica

Fratantoni, Silvina Andrea

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	biologia
Título:	Estudio inmunohistológico y electrofisiológico de la motoneurona en un modelo de transmisión pasiva de Esclerosis Lateral Amiotrófica
Autor:	Fratantoni, Silvina Andrea
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular
Publicación en la Web:	2017-03-01
Fecha de defensa:	1999
Fecha en portada:	1999
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor en Ciencias Biológicas
Director:	Uchitel, Osvaldo Daniel
Idioma:	Español
Palabras clave:	ESCLEROSIS LATERAL AMIOTROFICA; TRANSMISION NEUROMUSCULAR; MOTONEURONAS; PLACA NEUROMUSCULAR; CANALES DE CALCIO; NITRENDIPINAAMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS; NEUROMUSCULAR TRANSMISSION; MOTONEURONS; NEUROMUSCULAR JUNCTION; CALCIUM CHANNELS; NITRENDIPINE
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3181_Fratantoni
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3181_Fratantoni.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3181_Fratantoni
Ubicación:	Dep.BIO 003181
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Fratantoni, Silvina Andrea. (1999). Estudio inmunohistológico y electrofisiológico de la motoneurona en un modelo de transmisión pasiva de Esclerosis Lateral Amiotrófica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3181_Fratantoni

Resumen:

La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es la enfermedad neuromotora humana más común. Losindividuos que la padecen muestran disfunción y degeneración progresiva de motoneuronascerebrales, de la protuberancia y de la médula espinal lo cual se manifiesta clínicamente comouna debilidad muscular progresiva, parálisis y muerte dentro de los 3 a 5 años del diagnóstico. Noexiste una cura para esta enfermedad y su patofisiología permanece sin aclarar. Evidencias clínicas y experimentales apoyan la posibilidad de que un mecanismo autoinmuneesté involucrado en la patogénesis de ELA. En trabajos anteriores de nuestro laboratorio se hademostrado que la aplicación de inmunoglobulina G (IgG) de pacientes con ELA sobreterminales motores inducen una disfunción de la transmisión neuromuscular. Estudios animales han establecido que fisiológicamente la IgG y otras proteínas séricasendógenas son endocitadas por los terminales nerviosos de la placa neuromuscular. Estasproteínas pueden ser localizadas por técnicas inmunocitoquímicas en los somas donde seacumulan luego de ser transportadas por transporte axonal retrógrado. El objetivo de la primera parte de la tesis fue analizar si la captación de IgG es cuantitativamentediferente en el caso que la misma provenga de pacientes con ELA o de IgG controles (pacientescon otras enfermedades neurológicas o personas sanas). Para ello, hemos investigado la presencia de IgG humana de pacientes con ELA e IgG control enlos somas de las motoneuronas de ratón. La IgG fue aplicada sobre los terminales motores delmúsculo elevador de la oreja del ratón, Levator auris longus, el cual está inervado por una ramadel nervio facial. La fracción sérica de 7 pacientes con ELA, 6 sujetos controles y 3 pacientes con otrasenfermedades neurológicas fue inyectada subcutáneamente dos veces por día durante 5 dias (50μl cada vez de una solución de IgG 20 mg/ml). Secciones del tallo cerebral conteniendo el núcleo del facial fueron procesadas porinmunocitoquímica para detectar IgG humana y la inmunotinción fue cuantificada con unanalizador de imágenes. Para todas las IgG consideradas, la tinción en las motoneuronas delnúcleo del facial del lado ipsilateral al sitio de la inyección fue significativamente más intensa. En los animales tratados con IgG de ELA, la marca ipsilateral fue significativamente más alta quela encontrada en el lado ipsilateral de los animales inyectados con IgG control. Nuestrosresultados son compatibles con el concepto de que las motoneuronas preferencialmente captan,transportan y/o acumulan IgG de ELA. La captación de anticuerpos patogénicos por terminalesmotores podrían tener un rol en la patogénesis de la enfermedad de la motoneurona. Para definir el posible rol de las IgG de ELA en la inducción de la disfunción de la transmisiónneuromuscular, fue nuestro interés estudiar si la participación de canales de calcio voltajedependientes (CCVD) puede ser alterada por la transmisión pasiva dichos anticuerpos. En la placa neuromuscular de humanos adultos y también en la placa de ratón, la transmisiónsináptica está mediada por la entrada de calcio a través de CCVD del tipo P/Q. Otros canales decalcio, como los de tipo L y N, no están involucrados en la liberación de neurotransmisor. Sinembargo, en nervios en regeneración, la conducción de señales y la transmisión sináptica sehacen altamente sensibles a la nitrendipina, una dihidropiridina bloqueante de los canales decalcio de tipo L, sugiriendo que este canal estaría involucrado en la liberación deneurotransmisor. A fin de estudiar si la aplicación de IgG humana sobre los terminales motores induce cambios enla transmisión neuromuscular, IgG de pacientes con ELA y de sujetos controles fue inyectadasubcutáneamente sobre el músculo Levator auris del ratón. La fracción sérica de 8 pacientes con ELA y 6 sujetos controles (3 sujetos sanos y 3 pacientes conotras enfermedades neurológicas) fue inyectada subcutáneamente dos veces por día durante 5días (50 μl cada vez de una solución de IgG 20 mg/ml). Una semana o un mes después de laultima inyección, los ratones fueron anestesiados y los músculos removidos en solución Ringernormal. El músculo fue montado en una cámara de registro y el nervio fue estimulado por mediode un electrodo de succión. Los potenciales de placa fueron registrados en por lo menos l5 fibrasmusculares distintas antes y después de la incubación con Nitrendipina l μM o toxinaspolipeptídicas. El contenido cuántico de la respuesta evocada fue evaluado por el método de lavarianza. No se observaron cambios en el contenido cuántico de la liberación de neurotransmisor. En losmúsculos tratados con IgG de ELA o IgG control, la liberación del neurotransmisor permaneciósensible a los bloqueantes de CCVD de tipo P/Q e insensibles al bloqueante de tipo N, comoocurre en los músculos sin tratar. En contraste, las IgG de 5 pacientes distintos de ELA indujeronuna reducción significativa en el contenido cuántico de la respuesta evocada luego de laaplicación de Nitrendipina. Esto indicaría que una sensibilidad nueva a este bloqueante de CCVDaparece en los terminales tratados con IgG de pacientes con ELA. Estos resultados sugieren laparticipación del canal de calcio voltaje dependiente de tipo L en el proceso que llevaría a lamuerte neuronal inducida por las inmunoglobulinas de ELA.

Abstract:

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is the most common human motor neuron disease. Affectedindividuals show progressive dysfunction and degeneration of brain, brainstem and spinal cordmotor neurons, clinically manifested as progressive muscular weakness, paralysis and deathwithin a mean of 3 years. There is no cure available for this disease and its pathophysiologyremains unclear. Clinical and experimental evidence support an autoimmune etiopathogenesis for ALS. Previousstudies in our laboratory have shown that local application of immunoglobulin G (IgG) of ALSpatients onto nerve terminals induces dysfunction in neuromuscular transmission. In animalstudies, it has been established that endogenous IgG and other circulating serum proteins can betaken up by motor nerve terminals. They can be detected by immunocitochemistry in themotoneurons somas where they accumulate following retrograde axonal transport. Weinvestigated the presence of human ALS and control IgG in the soma of mice motoneurons. IgGwas applied onto motor nerve terminals by injections on the levator auris longus muscle which isinnervated by a branch of the facial nerve. The seric IgG fraction of 7 ALS patients, 6 control subjects and 3 patients with other neurologicaldiseases was injected subcutaenously, twice a day for 5 days, on the surface of the left Levatorauris longus muscle of adult mice (50 μl of 20 mg/ml IgG in PBS per application). Sections of the brainstem containing the facial nuclei were immunoprocessed to detect human IgG. For all lgG tested, motoneuron labeling was significantly more intense in the facial nucleusipsilateral to the site of injection. In ALS-IgG-treated animals, ipsilateral labeling wassignificantly stronger than that found on the ipsilateral side of control IgG-treated animals. Ourresults are compatible with the concept that motoneurons preferentially take up, transport and/oraccumulate ALS-IgG. Uptake of pathogenic antibodies by motoneuron terminals may play a rolein the pathogenesis of motoneuron disease. At both the mature mouse and human neuromuscular junction, synaptic transmission is mediatedby Ca² entry through voltage-sensitive calcium channels (VSCCs) of the P/Q-type family. Othercalcium channels, like the L- and N-type, are not involved in neurotransmitter release. However.in regenerating nerves, signal conduction and synaptic transmission become highly sensitive to Nitrendipine, a dihydropyridine antagonist of L-type calcium channel, suggesting that this type ofcalcium channel mediate transmitter release. Therefore, to further define the possible role of ALS IgG in the induction of NMJ dysfunction, itwas our interest to study if the participation of other types of VSCCs in transmitter release can beinduced by passively transferring these antibodies, as it was found in regenerating NMJ. In order to search for early changes induced by the application of human IgG onto the motornerve terminals, IgG from ALS patients and control subjects was injected on the mice Levatorauris muscle. The seric IgG fraction of 8 ALS patients and 6 control subjects (3 healthy subjects and 3 withother neurological diseases) was injected subcutaenously, twice a day for 5 days, on the surfaceof the left Levator auris longus muscle of adult mice (50 μl of 20 mg/ml IgG in PBS perapplication). A week or a month after the last injection, mice were anesthetized and the muscleremoved in Normal Ringer solution. The muscle was mounted in a recording chamber and thenerve was stimulated by a suction electrode. The end plate potentials were recorded from at least 15 different muscle fibers before and after the incubation with l μM Nitrendipine or polipeptidictoxins. The mean quantal content of the evoked response was evaluated by the coefficient ofvariation method. No changes in quantal content of transmitter release were observed. In control and ALS IgGtreated muscles, neurotransmitter release remained sensitive to P/Q-type and insensitive to N-type VSCC blockers as in untreated muscles. In contrast, IgG from 5 of 8 different ALS patientsinduced a significant reduction in the quantal content of the evoked response afler the incubationwith Nitrendipine, indicating that a novel sensitivity to this calcium channel blocker appears inthese motor nerve terminals. These results suggest the involvement of L-type VSCC in theprocess leading to neuronal death induced by ALS IgG.

Citación:

---------- APA ----------

Fratantoni, Silvina Andrea. (1999). Estudio inmunohistológico y electrofisiológico de la motoneurona en un modelo de transmisión pasiva de Esclerosis Lateral Amiotrófica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3181_Fratantoni

---------- CHICAGO ----------

Fratantoni, Silvina Andrea. "Estudio inmunohistológico y electrofisiológico de la motoneurona en un modelo de transmisión pasiva de Esclerosis Lateral Amiotrófica". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1999.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3181_Fratantoni

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