Registro:
| Documento: | Tesis Doctoral |
| Disciplina: | biologia |
| Título: | Importancia de la UDP-Glc : glicoproteína glucosiltransferasa de Schizosaccharomyces pombe en el plegamiento de glicoproteínas "in vivo" |
| Autor: | Fanchiotti, Sandra G. |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Filiación: | Fundación Instituto Leloir - CONICET. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires (IIBBA)
|
| Publicación en la Web: | 2023-05-09 |
| Fecha de defensa: | 1999 |
| Fecha en portada: | 1999 |
| Grado Obtenido: | Doctorado |
| Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Biológicas |
| Director: | Parodi, Armando J. |
| Jurado: | Romanosky, Víctor; Moreno de Colonna, Silvia; de Prat Gay, Gonzalo |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3393_Fanchiotti |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3393_Fanchiotti.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3393_Fanchiotti |
| Ubicación: | Dep.BIO 003393 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Fanchiotti, Sandra G.. (1999). Importancia de la UDP-Glc : glicoproteína glucosiltransferasa de Schizosaccharomyces pombe en el plegamiento de glicoproteínas "in vivo". (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3393_Fanchiotti |
Resumen:
La adición de oligosacáridos a residuos asparagina (Asn) de proteínas recientemente translocadas al retículo endoplásmico (RE) se encuentra relacionada al plegamiento de las glicoproteínas. La estructura o el grado de procesamiento de los oligosacáridos unidos ha sido postulado como una señal para la retención o el transporte de las mismas. El transporte hacia el aparato de Golgi ocurre únicamente cuando las proteínas se han plegado correctamente. El mecanismo que asegura la integridad funcional de las glicoproteínas que salen del RE ha sido denominado “control de calidad del RE”. La N-glicosilación comienza con la transferencia en bloque de un oligosacárido de 14 residuos (Glc3Man9GlcNAc2) desde un lípido transportador, el dolicol difosfato, a proteínas nacientes en el RE. Esta vía de glicosilación se encuentra basicamente conservada desde eucariotas inferiores hasta superiores. Luego de la transferencia a proteínas las glucosas terminales son procesadas por la actividad de dos glucosidasas específicas del RE, las glucosidasas I y II (GI y GH). Existe posteriormente una re-glucosilación transitoria de los oligosacáridos unidos a proteína por la acción de una enzima luminal, la UDP-Glczglicoproteína glucosiltransferasa Esta enzima glucosila glicoproteínas sustrato, en un ensayo libre de células, si éstas se encuentran desnaturalizadas. Por esta característica especial se le ha otorgado un rol como posible sensor del estado conformacional de las glicoproteínas en el RE. Los oligosacáridos monoglucosilados, que se generan por la de-glucosilación parcial por la GI (encargada de remover la glucosa más externa) y GII (encargada de remover las dos glucosas más internas) y por la actividad de la GT, permiten la interacción con dos lectinas del RE, la calreticulina soluble y/o calnexina de membrana. Esta interacción facilitaría el plegamiento de las glicoproteínas pero no resulta esencial para la viabilidad celular bajo condiciones normales. En la levadura Schyzosaccharomyces pombe existen los tres componentes propuestos del modelo de control de calidad de glicoproteínas en el RE. Previamente, en el laboratorio se obtuvo una mutante simple deficiente en GT (mutante gpt1). Esta mutante no poseía fenotipo distintivo.Por otro lado la disrupción del gen que sintetiza la calnexina de S. pombe resultó letal para estas células. En este trabajo de tesis se realizó la disrupción del gen alg6,que codifica para la enzima encargada de transferir la primera glucosa al oligosacárido unido a dolicol difosfato. Estas mutantes transfieren el oligosacárido no glucosilado y por lo tanto existe un patrón de proteínas hipoglicosiladas. También se obtuvo una doble mutante gpt1/alg6, en la cual no existe formación de oligosacáridos monoglucosilados. La simple mutante alg6 al igual que la gpt1 crece normalmente a 28 °C, mientras que la doble mutante gpt1/alg6 crece a esta temperatura lentamente con una morfología redondeada y es incapaz de crecer a 37 °C. El fenotipo “wild type” se recupera por transfección de la doble mutante con un plásmido de expresión que codifica para la GT o por agregado al medio de sorbitol 1M, indicando que está afectada la formación de la pared celular. Por otro lado, la doble mutante gls2/alg6 transfiere oligosacáridos no glucosilados hacia las proteínas y que es incapaz de remover la glucosa agregada por la GT por carecer de actividad de glucosidasa II, crece a 28 °C con morfología igual a las células “wild type” y puede crecer a 37 °C. Las conclusiones que se sugieren son que el plegamiento facilitado por la interacción de los oligosacáridos monoglucosilados con la calnexina es esencial para la Viabilidad celular bajo condiciones de estrés extremo como hipoglicosilación debida a la mutación alg6 y elevadas temperaturas. Por otro lado, los ciclos de glucosilación/deglucosilación no son aparentemente necesarios para el plegamiento facilitado por la calnexina. Por otro lado, el hecho que la formación de oligosacáridos monoglucosilados no sea esencial para la Viabilidad celular de S.pombe indica que la calnexina tiene otro rol independiente del reconocimiento de oligosacáridos monoglucosilados. También en este trabajo de tesis se han identificado dos aminoácidos requeridos para que la GT tenga actividad catalítica. Parte de estos resultados se publicaron en:—“The UDP-Glchlicoprotein Glucosiltransferase Is Essential for SabígasamammympombeViability under Conditions of Extreme Endoplasmic Reticulum Stress”. Sandra Fanchiotti, Fabiana Fernández, CeciliaD'Alessio, and Armando Parodi (1998) Thejour/za! of Cel!Biology,143, 625-635.
Abstract:
Addition of oligosaccharides to asparagine side Chains (Asn) of newly translocated proteins into de endoplasmic reticulum (ER) influences glycoprotein folding. The structure of the linked oligosaccharide or the trimming of terminal glucose residues has been proposed as signal for retention or transport of glycoproteins. The protein transport through the Golgi takes place only when the protein has been properly folded. The mechanism that ensures the functional integrity of the glycoproteins that exit the ER has been denominated “quality control of the ER”. N-glycosylation initiates with the transference of a core oligosaccharide (GIC3Man9GlcNAcz)from a lipid-carrier dolichyl pyrophosphate, to nascent proteins in the ER. This pathway is highly conserved from lower to higher eukaryotes. Terminal glucose residues of the transferred core oligosaccharide are trimmed by the activity of two specific glucosidases of the ER, the glucosidases I and II (GI and GH). Transient reglucosylation of the N-linked oligosaccarides takes place by the activity of a luminal enzyme, the UDP-Glczglycoprotein glucosyltransferase This enzyme glucosylates glycoproteins, in a cell-free assay, only if they have been previously denatured. For this especial characteristic, GT has been proposed as a possible sensor of glycoprotein conformation in the ER. Monoglucosylated oligosaccharides can be generated be sequential action of GI (that removes the most terminal glucose) and GII (that trims the innermost glucose residues), or by the GT. Monoglucosylated oligosaccharides allow interaction with two ER lectins, soluble calreticulin and/ or membrane protein calnexin. This interaction facilitates glycoprotein folding but it is not essential for cellular viability under normal conditions. The yeast Schyzosaccharomyces pombe has the three elements required for the quality control of ER glycoprotein folding. Previously, in our laboratory a single mutant lacking GT activity (gpt1) was obtained. This mutant had no discernible phenotype, on the other hand, the disruption of the gene encoding calnexin in S.pombe was found lethal. In this Doctoral Thesis we disrupted the alg6+ gene responsible for the transference of the first glucose to the oligosaccharide dolichyl phosphate linked. Hypoglycosylation of cellular glycoproteins is apparent in this mutant due to incomplete assembly of oligosaccharide donor. We also obtained a double mutant gpt1/alg6,in witch monoglucosylated oligosaccharides are not formed. Both single mutants (gpt1 or alg6)grew normally at 28 °C, however, gpt1/alg6 double mutant cells grew very slowly and with rounded morphology at 28 °C and did not grow at 37 °C. The wild type phenotype was restored by transfection of the double mutant with a GT-encoding expression vector or by addition of 1 M sorbitol to the medium, indicating that the double mutant is affected in cell wall formation. In contrast, gls2/alg6 double-mutant cells that transfer non-glucosylated oligosaccharides and that are unable to remove the glucose units added by GT as they lack GII, grew at 37 °C and had, when grown at 28 °C, a phenotype of growth and morphology almost identical to that of wild-type cells. The results suggest that facilitation of glycoprotein folding mediated by the interaction of monoglucosylated oligosaccharides with calnexin is essential for cell viability under conditions of extreme ER stress such as underglycosylation of proteins caused by the aégá mutation and high temperature. Besides, the cycles of reglucosylation-deglucosylation are not required for the facilitation of glycoprotein folding mediated by the interaction of calnexin. The fact that formation of monoglucosylated oligosaccharides is not essential for S. pombe viability indicates that calnexin may have another essential role, independent of its recognition of monoglucosylated oligosaccarides. In addition, we have identified two amino acid residues that are apparently required for GT catalytic activity. Some of the results obtained in this Ph. D. Thesis where included in the following publication:--“The UDP-Glchlicoprotein Glucosiltransferase Is Essential for S¡17222050mzmmyces pombeViability under Conditions of Extreme Endoplasmic Reticulum Stress”. Sandra Fanchiotti, Fabiana Fernández, CeciliaD 'Alessio, and Armando Parodi (1998) Thejournal ofCeZZBiology,143, 625-635.
Citación:
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Fanchiotti, Sandra G.. (1999). Importancia de la UDP-Glc : glicoproteína glucosiltransferasa de Schizosaccharomyces pombe en el plegamiento de glicoproteínas "in vivo". (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3393_Fanchiotti
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Fanchiotti, Sandra G.. "Importancia de la UDP-Glc : glicoproteína glucosiltransferasa de Schizosaccharomyces pombe en el plegamiento de glicoproteínas "in vivo"". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1999.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3393_Fanchiotti
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